GenomONE^®–Neo EX 仙台病毒包膜转染试剂

可用于DNA、siRNA、ODN及蛋白转染！

◆原理

　　待转移的分子（如DNA，蛋白，Antisense Oligonucleotide, siRNA等）与 HVJ-Envelope（HVJ-E）混合后，形成了 HVJ-E 载体。利用病毒衣壳蛋白的侵染能力，在融合蛋白(F)的作用下，直接与细胞融合，将分子转入目标细胞或组织。

　　*　HVJ-E：Hemagglutinating Virus of Japan Envelope。

　　** 现已有200多篇文献使用该试剂盒，如需样本案例，请向我司索取。

◆优点、特色

      目前市面上独一无二的转染试剂盒，可用于细胞、组织和活体动物。可用于：

siRNA
      少量 siRNA 也可高效发挥敲除作用，无需化学修饰siRNA，高表达量。

DNA
      无论序列长短、线性或环状均可

Oligonucleotides
      DNA、RNA

蛋白
      保持酶和抗体的功能性与特异性

体内转染 !!
      大量操作和文献引用证明HVJ-E载体可直接将目标分子转移到活体动物产生作用。

高通量筛选
      可同时转染多种分子

1.　运用范围广
     GenomONE HVJ-E 载体试剂盒可将多种分子（质粒 DNA、siRNA、寡核苷酸、蛋白、抗体等）转进培养细胞（贴壁和非贴壁细胞）和组织。也可用于敏感原代细胞和 活体动物转染。每种领域的GenomONE^®-Neo EX 运用情况，均有大量文献报道。（如需文献列表，请向我司索取）

2.　安全性
     与阳离子脂质体不同，GenomONE^®-Neo EX 是通过膜融合作用将分子导入细胞，而脂质体转染的内吞作用可能造成转染分子经溶酶体作用而降解。GenomONE^®-Neo EX 内含完全灭活的HVJ病毒颗粒，其具有侵染力而无潜在增殖能力，使用非常安全，无需特殊的防护措施    

3.　方便简单
     GenomONE 即开即用，试剂盒内包含了操作中主要使用的 HVJ-E 冻干粉和各种辅助试剂      

◆案例、应用

　　GenomONE^®-Neo EX 和传统的脂质体转染和电穿孔法相比，有更高的转染效率和更低的细胞毒性，可更有效的发挥 siRNA 的 knock-down 作用。

■ in vivo

【大鼠颌下腺逆行注射siRNA】

　　Ca²⁺-dependent Cl channel protein（rCLCA）表达的特异性抑制。

免疫染色

　　　non-injection side   　　　　　　　　　　　　　　rCLCA siRNA-injection side

　　rCLCA siRNA（2 nmol）和GenomONE-Neo（2AU）混合后，以逆行注射的方式注入大鼠颌下腺。四十八小时后，用免疫染色检验 siRNA 注射对氯离子通道蛋白表达的抑制作用。
　　ST：纹状管，G：颗粒曲管，A：腺泡

　　【相关文献】

　　K. Ishibashi et al., J. Dent. Res., 85(12), 1101-1105 (2006).

■ in vitro

【难转染细胞——U937 细胞 RNAi】

　　总所周知，用脂质体和电转的方法将 siRNA 转到 U937 人单核细胞白血病细胞中非常困难，但我们通过实验证明，siRNA 与 GenomONE-Neo 结合后转染该细胞，其 knock-down 效率可达85%以上。

♦ U937 细胞经 siRNA 转染72小时后收集，用 RT-PCR 和 WB 分别检测 mRNA 和蛋白量的变化情况。

Real-time PCR　　　　　　　　　　　　　Western blotting

　　左图：转染 Cathepsin G 的特异性 siRNA 后，其对应的 mRNA 减少到14%

　　右图：转染 Cathepsin G 的特异性 siRNA 后，其蛋白水平减少到15%

　【相关文献】 
　　Y. Tsuchiya et al, Free Radical Biology & Medicine, 43, 1604-1615 (2007).

◆试剂盒组成

【相关资料】

GenomONE-Neo EX 操作手册

GenomONE siRNA案例

GenomONE(TM)-Neo EX HVJ-E Transfection Reagents产品说明书

转染专题宣传单页

同系列相关产品

请参考附件：

GenomONE-Neo EX 常见问题1.pdf

GenomONE-Neo EX_问题解决指南1.pdf

参考文献

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请参考附件：

GenomONE_参考文献_体外实验.pdf

GenomONE_参考文献_体内实验.pdf

GenomONE ^® –CF EX

GenomONE ^® 仙台病毒包膜细胞融合试剂

　　GenomONE^®–CF EX 含有仙台病毒包膜和专用缓冲液，可促使细胞融合。

适用于贴壁/悬浮状态的所有细胞，仅需 30 min，即可制备融合细胞和杂交瘤。

◆用途

●　制备杂交瘤

●　应用于癌细胞与树状细胞融合的癌症免疫研究

●　应用于内脏来源细胞与干细胞融合的再生医疗研究

●　应用于去核未受精卵的核移植等的发育、繁殖和育种研究

●　替代电融合法、PEG 法

◆HVJ Envelope（HVJ-E）：

　　HVJ 包膜（HVJ-E）是完全灭活和纯化仙台病毒（HVJ*），即只留下细胞膜融合能力的衣壳蛋白包膜。仙台病毒的HN蛋白可与细胞膜外的唾液酸受体结合，通过Ｆ蛋白的作用，引起细胞膜融合。在 HVJ-E 中，仙台病毒的基因组 RNA 已经完全失活，在人类和实验动物体内不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和设备，它可以安全地在普通的实验室使用。

*HVJ：日本仙台病毒

◆HVJ-E 细胞融合原理

在低温（0 – 8℃)条件下，每一个细胞与数百个以上的 HVJ – E 接触，HVJ – E 与细胞膜上的唾液酸受体结合，通过细胞表面吸附（步骤１），细胞通过 HVJ-E 相互连接（步骤２），形成细胞彼此聚集的状态。当该细胞/HVJ-E 的复合物加热到 37℃ 时，细胞膜干扰就会进一步扩大，细胞膜内膜结构也暂时改变。这种变化是短暂的，随后会立即返回到正常结构，但是在这个期间，细胞膜利用强疏水性结合力进行相互融合（步骤３）。

步骤一	步骤二	步骤三

◆应用方法

悬浮法	电融合法

◆悬浮细胞融合案例

同种细胞融合

异种细胞融合

　　荧光标记的红（* 1）细胞和绿色荧光标记（* 2）细胞（每1.0×10⁵个）在融合缓冲液 50 μL 混合后，加入 HVJ-E 冰敷５分钟，随后 37℃ 下反应 15 分钟后，融合细胞（黄色）进行了观察。

◆黏着态和悬浮态细胞融合案例

在粘合状态BHK-21（红）和在浮动状态（绿色）的P19细胞的融合

胶粘状态的HeLa S3（红）在浮动状态（绿色）的P19细胞的融合

　　荧光标记的（* 1）中的红，附着的细胞在 12 孔平板，绿色荧光标记（* 2）中，添加预先准备的 HVJ-E，来处理漂浮细胞１×10⁵个的悬浮液（融合缓冲污染），并在室温下离心（1000转），每个板５分钟。随后孵育37℃15分钟后，更换增殖用的培养基继续细胞培养。观察３个小时后的融合细胞（黄色）。

◆和 PEG 法的比较

　　红色荧光标志(* 1）的 ratMSC（骨髓由来老鼠间叶系细胞）和绿色荧光标识的老鼠原代培养心肌细胞２×10⁵个融合缓冲液 50 μL 中混合后，添加 HVJ – E，冰浴５分钟，然后 37℃ 孵育反应15分钟，观察融合细胞（黄色）。１-２日培养后，观察到粘着的融合细胞。在 PEG 法中融合紧接之后细胞毒性强烈，融合细胞的数量很少。

◆安全性说明

HVJ-E 失活的确认（确认无感染性病毒的存在）

相关资料

Q&A

Q1：什么是GenomONE^®–CF EX？
A1：GenomONE^®–CF EX 是由 HVJ 包膜（HVJ-E）和特殊缓冲液组成的细胞融合试剂盒。 它可以用于贴壁细胞和悬浮细胞。 使用该试剂盒

A1：融合相同或不同类型的细胞只需30分钟。

Q2：HVJ-E的特性？
A2：HVJ包膜是通过完全灭活的仙台病毒（HVJ：日本血凝素病毒）纯化后的产物。 它是一种囊泡，其中仅保留仙台病毒具有细胞膜融合能力

        的包膜蛋白。 众所周知，在鞘膜外耳炎（包膜）仙台病毒中的HN蛋白能识别细胞膜上的受体（在糖链的末端具有唾液酸）并且将其吸收，

        从而通过F蛋白（包膜的另一组分）介导膜融合。 HVJ-E中包含的仙台病毒基因组RNA已经完全灭活，并且在人或实验动物中既不能感染

        也没有增殖潜力。HVJ-E可以在普通实验室中安全使用，无需任何特殊操作或设施。

Q3：失效日期？
A3：在铝纸包装上印刷了冻干的 HVJ-E 的保质期。

Q4：对于 HVJ 灭活方法？
A4：虽然HVJ-E使用HVJ（仙台病毒/鼠副流感病毒1）作为原料，但HVJ的基因组RNA已经通过药物治疗而完全灭活*。 HVJ-E不会在人或动物

        中增殖或表现出致病作用。

A4：参考文献：Prior, P. et al.: BioPharm, 22-33 (Oct. 1996) Kaneda, Y. et al.: Advances in Genetics, 53, 308-332 (2005).

Q5：病毒灭活的评估和确认？
A5：通过对培养的细胞和生长的鸡蛋进行病毒增殖性电位排除试验，证实了每批的 HVJ 已经失活。

Q6：确认病毒灭活的方法？
A6：通过以下三种方法证实了在人或实验动物中缺乏HVJ-E的感染或增殖的可能性。
A6：（1）使用培养细胞的测定
A6：（2）使用受精的鸡蛋进行测定
A6：（3）使用小鼠进行测定

Q7：实验室生物实验安全级别，使用注意事项？
A7：GenomONE^® 可以在普通实验室安全使用。虽然 HVJ-E 使用 HVJ（仙台病毒/鼠副流感病毒1）作为原料，但HVJ的基因组RNA已经通过

        药物治疗而完全灭活。 HVJ-E不会在人或动物中增殖或表现出致病作用。

        然而，当使用该产品进行细胞融合实验时，产生的重组生物体等可能属于卡塔赫纳生物安全议定书的限制。

        使用本产品生产重组生物体的实验者必须采取适当措施，防止此类生物体扩散，然后再使用本产品进行实验。
        此外， DNA 重组实验，必须遵循重组 DNA 实验规则（在使用国的相关法规中规定或由相关设施的安全委员会规定），并且实验只能在具

        有合适设施的实验室中进行 DNA 重组实验。

Q8：质量保证？
A8：
A8：◆　通过对培养细胞和受精鸡蛋的病毒增殖性电位排除试验，确认每批 HVJ 的灭活。
A8：◆　无菌检测证实了不存在细菌和真菌污染。
A8：◆　内毒素水平已被证实小于 2.5 EU / mL（鲎细胞裂解物凝胶凝块测定）。

Q9：许可证要求和商业用途？
A9：本产品由一个或多个专利的权利要求所覆盖，并且仅授予研究用途。 未经制造商事先书面许可，不得用于任

A9：何商业或其他目的，或在修改后转售等（Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.）。

Q10：每种试剂的作用？
A10：
A10：◆　冻干的 HVJ-E：HVJ-E 是通过完全灭活 HVJ（仙台病毒）制备的纯化囊泡，其中仅保留 HVJ 具有细胞膜融合能力的包膜蛋白。

A10：◆　HVJ-E悬浮缓冲液：用于复融，重悬，稀释 HVJ-E 或其他目的的生理浓度的中性缓冲液。
A10：◆　细胞融合缓冲液：用于细胞融合的优化缓冲液。
A10：◆ “细胞融合缓冲液（20X浓缩物）”应在使用前用无菌纯水（例如，不含内毒素的注射用水）以1：20 稀释。

Q11：每种试剂的成分和浓度？
A11：无相关数据。

Q12：重组 HVJ-E 悬浮液的储存？
A12：
A12：◆　为了连续使用，请在冰箱（２-８°C）存放最多两个星期。
A12：◆　对于长期储存，根据每次使用量将试剂分装保存在 -80℃ 下冷冻最多３个月。 冷冻后只能解冻一次。

Q13：“HVJ-E 悬浮缓冲液”和“细胞融合缓冲液（20X）”的保存？
A13：储存在冰箱（２-８°C）。 不要冻结。

Q14：HVJ-E 的粒度？
A14：约 300 nm（200-400 nm）

Q15：HVJ-E 颗粒数？
A15：40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液包括约 109-1010 个 HVJ-E 颗粒。

Q16：HVJ-E 的血细胞凝集单位（HAU）？
A16：40 mL 复融的 HVJ-E 悬浮液，相当于约 1,000-2,000个血凝单位（HAU）。

Q17：使用频率？
A17：
A17：◆　对于相同或不同类型的细胞的融合：约 100 次
A17：◆　用于制备Ｂ细胞杂交瘤：约 10 次

参考文献

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