LipiRADICAL Green（检测试剂）/OH-Pen（抑制物质）
脂质过氧化研究的新工具！脂质自由基检测试剂和抑制物质
LipiRADICAL Green是特异性荧光检测脂质过氧化反应的上游因子脂质自由基的试剂。可用于活细胞成像、样品中脂质自由基含量的相对定量以及样品中脂质自由基的结构分析和全面鉴定。另外，OH-Pen还可作为脂质自由基特异性中和剂使用。
※ 本产品基于九州大学大学院药学研究院 生命物理化学领域 山田健一教授的研究结果商品化并销售。
※ 本产品仅供研究用，研究以外不可使用。
本试剂的概要图和活细胞成像示例
脂质自由基发生特异性反应产生绿色荧光的LipiRADICAL Green原理示意图（左），以及用药物刺激Hepa1-6细胞时的活细胞成像示例（右）。
◆什么是脂质过氧化反应（LPO）和脂质自由基（Lipid radical）？
脂质过氧化反应（lipid peroxidation; LPO）是指由于氧化应激脂质被氧化分解的反应，是脂质分解的过程之一。以含有多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid; PUFA）的脂质为起点，目前已提出两种脂质过氧化反应的发生过程：
1.氧化应激引起的脂质自由基产生
2. Lipoxygenase引起的过氧化脂质生成和铁离子依赖性过氧化脂质自由基的产生
第1种发生过程是由含PUFA的脂质暴露于氧化应激（活性氧ROS）时产生脂质自由基（L.；Lipid radical）开始。脂质自由基容易被氧化并转化为过氧化脂质自由基（LOO・; Lipid peroxyl radical），诱导自由基连锁反应。在第2种发生过程中，含PUFA的脂质被过氧化催化酶lipoxygenase转化为过氧化脂质（LOOH），并在存在大量的铁离子Fe2+ 时会诱导产生过氧化脂质自由基（LOO・）。过氧化脂质自由基与其他脂质反应，诱导自由基连锁反应。
两种过程所产生的过氧化脂质自由基（LOO・）都会在与其他脂质发生自由基反应并扩大自由基连锁反应，同时产生各种过氧化脂质（LOOH）。该自由基连锁反应直至被抗氧化剂聚合前会持续进行，并生成各种脂质结构或醛，最终产生复数的反应活性醛，如acrolein、malondialdehyde（MDA）、4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE）等。以这些下游活性物质为起因，会对ER应激、细胞毒性和诱导铁死亡等产生各种影响。
脂质自由基（以及过氧化脂质自由基）被认为是脂质过氧化反应中最重要的最上游因子，虽然其检测方法备受期待，但直到现在，也仅有电子自旋共振（ESR）法等需要特殊设备的方法。LipiRADICAL Green和OH-Pen是由九州大学大学院药学院研究院生命物理化学系的山田健一教授等人开发的、具有新型氮氧化物骨架的脂质自由基响应性荧光试剂（原著名称为NBD-Pen）和抑制剂，它们不与活性氧自由基反应，实现特异性响应脂质自由基。由于LipiRADICAL Green可通过荧光检测来观察/分析脂质自由基，因此可用作以脂质自由基为中心的脂质过氧化反应的新工具。OH-Pen是从LipiRADICAL中去除荧光基团NBD的化合物，与一般的自由基中和剂（TEMPO等）不同，对脂质自由基显示高选择性，可作为脂质过氧化反应的特异性抑制剂使用。
◆原理
LipiRADICAL Green是向稳定自由基化合物的氮氧化物衍生物中添加荧光色素NBD的化合物。由于氮氧化物对脂质自由基显示高特异性，所以导入了戊基。LipiRADICAL Green此时处于消光状态，但通过脂质自由基与自由基-自由基偶联形成共价键后，显示绿色荧光。通过观察该绿色荧光强度，可相对定量样品中脂质自由基含量。
OH-Pen是LipiRADICAL Green的NBD转化为羟基的化合物，显示相同的脂质自由基选择性以及拥有相同的脂质自由基中和作用。因此可将其用作脂质过氧化反应的抑制剂。
概述：对使用LipiRADICAL Green的脂质自由基进行全面分析
通过使用LipiRADICAL Green的荧光检测LC/MS-MS法可全面分析脂质自由基和过氧化脂质自由基。原著论文5中，已成功地从5种类型的PUFA中鉴定出共计132种脂质自由基。以下为流程概述，详细的实验方案、LC/MS-MS设置方法/分析方法，请参阅原著论文5。
■概述
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步骤1
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添加本试剂至含脂质的自由基样品中，并荧光标记脂质自由基。
※ 若是动物实验，将本试剂施药于小鼠等动物并在动物体内荧光标记脂质自由基后，马上摘除器官并提取脂质组分。
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步骤2
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通过荧光检测LC/MS进行绿色荧光标记产物的质量分析。
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步骤3
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减去所得质量值中LipiRADICAL Green的分子量（理论值389.2068），并推断结构。
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◆特点
LipiRADICAL Green
● 本试剂为消光状态，与脂质自由基/过氧化脂质自由基特异性反应，发出绿色荧光。
● 检测波长标准：激发470 nm /荧光520-600 nm（最大~540 nm）。
※ 详情请参阅数据。
● 对脂质自由基和过氧化脂质自由基具有特异性，在活性氧（H2O2、ClO–・、O2–・、・OH）中不发出荧光。
● 可通过荧光强度相对定量体外样品中的脂质自由基含量。
● 施药于动物个体后，可在组织水平上进行染色以及相对定量活体内的自由基含量。
※ 由于脂质自由基非常不稳定且会迅速分解，需要对实验方法和条件设置进行验证。详情请参阅原著论文1。
● 可用于评价任意化合物的脂质自由基诱导活性和抗氧化活性。
※ 详情请参阅原著论文4。
● 通过用荧光检测LC/MS可全面结构分析脂质自由基和过氧化脂质自由基。
※ 脂质自由基和过氧化脂质自由基的结构分析方法，请参考原著论文5。
OH-Pen
● 与脂质自由基和过氧化脂质自由基发生特异性反应以抑制自由基连锁反应，可用作脂质过氧化反应信号上游的抑制剂。
● 虽然是自由基化合物，但非常稳定，可体外施药至动物个体。
● 肝细胞癌的动物实验模型（diethylnitrosamine（DEN）给药模型）中显示，可抑制DEN诱发的脂质过氧化反应信号和组织损伤标志物。
注意：LipiRADICAL Green和OH-Pen的区别在于有无荧光基团（请参阅“原理”），对脂质自由基的反应性相同，同时使用时，可能会引起对
注意：脂质自由基的竞争性反应，因此需注意使用方法。
◆原著论文
1) Yamada Nat. Chem.Biol.,12,608～613(2016)Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals.
2) Enoki et al., Chem.Commun.,53,10922～10925(2017)Lipid radicals cause light-induced retinal degeneration.
3) Ishida et al., Free Radical Biol.Med.,113,1487～493(2017)Detection and inhibition of lipid-derived radicals in low-density lipoprotein.
4) Mishima et al., J.Am. Soc.Nephrol.,31,280～296 (2020)Drug Repurposed as antiferroptosis agents suppress organ damage, including AKI, by functioning as lipid peroxyl radical scavengers.
5) Matsuoka et al.,Anal. Chem.,92,6993～7002(2020)Method for Structural Determination of Lipid-Derived Radicals.
◆参考数据
脂质自由基特异性荧光光谱
添加花生四烯酸（AA）和Lipoxygenase（LOX）至LipiRADICAL Green，观察470 nm的激发荧光。在未添加LOX的条件下，几乎没有观察到荧光，而添加LOX并产生脂质自由基后，可观察到500-650 nm范围内的荧光（最大540 nm附近）（左）。由此看出，荧光强度取决于添加的LOX浓度（右）。
自由基特异性
观察在以下条件中添加各试剂至LipiRADICAL Green的荧光强度（激发470 nm/荧光530 nm）。可观察到活性氧中的荧光几乎没有变化，而通过LOX酶或氧化诱导物质（AAPH和MeO-AMVN）的3种脂质产生的脂质自由基产生时的荧光强度有所上升。
H2O2, ClO– , KO2（O2–・）,・OH ：0.5 mM Lipids 0.5 mM (LA: linoleic acid, ALA: α-linoleic acid, AA: arachidonic acid ) + LOX 2.5 μg/mL or AAPH 10 mM or MeO-AMVN 50 μM
◆应用数据
活细胞成像
添加LipiRADICAL Green（1 μM）至Hepa1-6细胞培养20 min后，追加致癌性亚硝胺化合物DEN（30 mM）培养20 min，然后每隔2 min用激光共聚焦荧光显微镜进行活细胞成像（激发458 nm/荧光490-674 nm）。经DEN处理的细胞在添加试剂后，荧光强度立即随培养时长的增加而增加，这表明DEN是按顺序产生脂质自由基的。荧光显微镜图像为添加试剂后20 min内的数据。
体外检测LDL来源的脂质自由基
用氧化诱导物质Hemin或AAPH处理纯化的低密度脂蛋白LDL（20 μg protein/mL），添加LipiRADICAL Green（10 μM）并观察1 h内的荧光强度（激发470 nm/荧光530 nm），可检测到Hemin、AAPH随时间推移和试剂浓度依赖性荧光强度的增加，出现了不同的增加趋势。
脂质自由基结构分析
1）评价由氧化诱导剂（AAPH + Hemin）产生的自由基
体外添加LOX（10 μg/mL）和氧化诱导物质AAPH+Hemin（10 μM）至花生四烯酸（AA）中，诱导脂质自由基后添加LipiRADICAL Green并进行检测反应。之后通过Bligh＆Dyer法纯化脂质成分，并用荧光LC/MS-MS对AA产生的自由基进行全面分析。
上图：荧光LC色谱（激发470 nm/荧光530 nm）。检测出多个峰，对各个峰进行MS-MS分析。
下图：用MS-MS分析比较经鉴定的各种脂质自由基生成量（注：用各自由基种类的LC峰面积的相对定量）。鉴定出8种类型的AA过氧化脂质自由基（圆图中的红线），此外还鉴定了由AA裂解产生的29种脂质自由基（条形图、绿线）。
* 有关详细的实验方案和分析方法，请参阅原著论文5。
2）DEN诱导时内源性产生的脂质自由基检测
向小鼠施以致癌性亚硝胺化合物DEN，分别在1 h、4 h、24 h后进行麻醉，向腹腔内施以LipiRADICAL Green，之后切除肝脏并压碎，用Bligh＆Dyer法制备脂质提取液。并用荧光LC/ MS对各提取物进行各脂质自由基的鉴定以及相对定量。另外，NBD-Pen给药前15 min先施以脂质自由基抑制剂OH-Pen。可观察到左图所示的荧光LC色谱图，用MS/MS分析鉴定出共计11种类型的脂质自由基。随时间观察各脂质自由基种类（右图为C5H11的检测结果），可观察到DEN给药4 h后质谱峰面积大幅增加，而24 h后减少。LipiRADICAL Green给药前，经OH-Pen处理的小鼠脂质自由基被明显抑制。
* 有关详细的实验方案和分析方法，请参阅原著论文5。
3）使用本试剂进行体外鉴定脂质自由基
使用本试剂从5种PUFA【亚油酸（LA），α-亚麻酸（ALA），花生四烯酸（AA），二十二碳六烯酸（DHA），二十碳五烯酸酯（EPA）】中经LOX、AAPH以及Hemin处理后鉴定的脂质自由基列表如下（摘自原著论文5）。
通过OH-Pen抑制亚硝胺诱导肝细胞癌
向大鼠施以致癌性亚硝胺化合物DEN后，1 h后再施以OH-Pen。分别切除慢性模型12周后和急性模型24 h后的大鼠肝脏。
上图：慢性模型的肝癌。DEN给药使恶性肿瘤亢进，而施以OH-Pen可明显抑制该反应。
中图：急性模型LPO代谢产物的定量评价。发现OH-Pen抑制了DEN引起的MDA、4-HNE及Acrolein这三种LPO下游产物的增加。
下图：急性模型组织损伤标记物的定量评价。发现OH-Pen抑制了DEN引起的8-OHdG、ALT及细胞凋亡量的增加。
这些结果显示，DEN引起LPO亢进并产生脂质自由基后会诱导各种毒性信号，但OH-Pen可通过抑制初期脂质自由基连锁反应来抑制癌变。
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