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质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase®
本产品是质谱分析前处理时常用的蛋白分解酶即赖氨酰肽链内切酶，该酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽，可用于蛋白测序分析和 Lys-X 化合物的酶合成。若同时使用赖氨酰肽链内切酶和胰酶，可更好地切断赖氨酸基团的多肽，增加多肽的数量。产品已按照使用习惯做成小包装，是方便使用的冷冻干燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。
来源：细菌
外观：冻干粉（包含２ mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８）
活性：0.03～0.07 AU/vial
分子量：27,000（琼脂糖过滤），30,000（SDS-PAGE）
溶解性：溶于水或缓冲液
稳定性：溶解于 pH 值 5.0-12.0 的 Tris 缓冲液中，可在４℃稳定保存２年；在 pH 值 6.0-11.0、30℃时能稳定保存，但温度超过50℃时不稳定。
最适pH值：9.0~9.5
等电点：6.9~7.0
底物特异性：
可水解底物——Tos-Lys-OMe、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA
不可水解底物——Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNA、Arg-pNA
抑制剂：DFP、PMSF、TLCK
◆特点
● 高特异性、高蛋白质消化率、适用于蛋白质谱分析
● 提高裂解效率、增加肽段数量
● 根据使用量特意制备小包装，方便使用
◆应用
分别采用胰蛋白酶（Tp）、赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）和 Tp与Lys-C 联用进行胶内酶切的效果比较。
牛血清蛋白 BSA 的条带（100 ng）通过 SDS-PAGE 获得，然后分别用 Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 进行酶切，再用 MALDI-TOFMS 法进行分析。
这些蛋白酶的实验效果见下表。
表 1：Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 的结果对照
这些结果表明 Lys-C 酶解的错误裂解率最低。Tp 酶解时加入 Lys-C 后，错误裂解率有所降低，同时，可以鉴定出更多的多肽。
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Tp |
Lys-C |
Lys-C+Tp |
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裂解位点 |
精氨酸和赖氨酸的Ｃ端 |
赖氨酸的Ｃ端 |
精氨酸和赖氨酸的Ｃ端 |
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错误裂解率 (错误裂解所占比例 ) |
多（８%） |
很少（０%） |
少（３%） |
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鉴定出的多肽数量 |
１７ |
１９ |
２２ |
胰蛋白酶（Tp）（图 ａ）和赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）+Tp（ 图 ｂ）酶切后的质谱结果对照图。
Lys-C+Tp 酶切后，可以在 m/z=2000 时得到吸收峰，而单独的 Tp 酶切在 m/z=2000 时没有吸收峰。该结果表明 Lys-C 可以提高测序覆盖度。
( 数据由大阪医疗中心和妇婴健康研究所Ｙ. Wada 博士提供 )
赖氨酰肽链内切酶
赖氨酰肽链内切酶，最初由 Masaki 等人从土壤细菌中分离得到。该酶可以特异性剪切赖氨酸残基Ｃ末端和Ｓ-氨乙基半胱氨酸残基的肽键，用于蛋白测序和 Lys-X 化合物的酶催化合成。该酶稳定性高，在４Ｍ尿素或 0.1% SDS 溶液中 30℃ 孵育６小时之后，仍然拥有完整的生物活性。
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外观 |
冻干粉（包含ca. 10% Tris-HCl buffer，pH 8） |
活性 |
见包装 |
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分子量 |
27,000（凝胶过滤）；30,000 (SDS-PAGE) |
溶解性 |
易溶于水或缓冲液 |
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最佳pH |
9.0-9.5（酰胺酶的最佳活性 pH） |
等电点 |
6.9-7.0 |
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抑制剂 |
DFP、PMSF、TLCK |
来源 |
细菌 |
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稳定性 |
溶于pH 值 5.0-12.0 的缓冲液中，可于４℃稳定保存。溶于pH 值 6.0-11.0 的缓冲液中，可于30℃稳 定保存，但是50℃及以上不稳定。 |
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单位定义 |
一单位酰胺酶（AU）指在30℃ pH 9.5 时每分钟产生１ μmol 对硝基苯胺所需的酶量。 |
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底物特异性 |
水解底物：Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA |
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非水解底物：Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA |
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实验方法
1. 试剂：
A．0.2 mol/L AMP 缓冲液，pH值 9.5
溶解 4.2 g 的２-氨基-２-甲基-１,３-丙二醇于 150 mL 的水中，加入1 mol/L HCl 调 pH 值至 9.5，再加水使体积至 200 mL。
B．2.5 mmol/L 底物溶液
溶解 22.6 mg 的Ｎ-苯甲酰基-ＤＬ-精氨酰-４-硝基苯胺盐酸盐于 20 mL 水中。
C. 2 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８
溶解 0.24 mg的２-氨基-２-羟甲基-１,３-丙二醇于 900 mL 水中，加入 0.1 mol/L HCl 调pH值至8，再加水使体积至１ L。
D. 酶溶液
溶解１vial 的赖氨酰肽链内切酶于１mL 的溶剂Ｃ中，可直接加入。
E． 终止溶液
将 55 mL 水和 45 mL 乙酸混合均匀。
2. 步骤
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试剂 |
检测样品 |
空白对照 |
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A |
2.6 mL |
2.6 mL |
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B |
0.3 mL |
0.3 mL |
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30℃ 预培养5分钟 |
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D |
0.1 mL |
– |
|
C |
– |
0.1 mL |
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立即混合均匀，30℃ 预培养25分钟 |
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E |
1.0 mL |
1.0 mL |
3. 单位的定义
酰胺酶单位是指 30℃、pH 9.5 时，每分钟产生１μmol 对硝基苯胺的酶量。
AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)
a. 检测样品中的吸光度
b. 空白对照中的吸光度
胶内酶切的实验操作流程
用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端防止捕获任何蛋白。使用质谱分析用凝胶染色试剂盒，例如银染剂 MS 试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色 MS 试剂盒（产品编号：293-57701）
1. 电泳分离蛋白质样品；
2. 从凝胶中切割蛋白质片断并放入微量离心管；
3. 使凝胶脱色（可使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液）；
4. 加入300 μL 乙腈到试管里，搅拌器振荡 30 分钟；
5. 去除乙腈，用 Parafilm 膜覆盖微量离心管。
6. 在 Parafilm 膜上打出针孔，真空干燥 15 分钟；
7. 100 μL 10 mmol/L DTT 溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，56℃恒温１小时。
8. 室温冷却后，用等量的 50 mM 碘乙酰胺溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，暗处恒温 45 分钟并涡旋；
9. 用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵洗涤凝胶片段 10 分钟；
10. 用 300 μL 乙腈干燥凝胶片段 15 分钟；
11. 用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵溶胀凝胶片段 15 分钟；
12. 用 300 μL 乙腈再次干燥凝胶片段 15 分钟；
13. 去除液相，真空干燥凝胶片段 15 分钟；
14. 用 100 μL 赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片段 45 分钟；
*赖氨酸内切酶稀释于 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5；
15. 去除 100 μL 赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放在 37℃、10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 中过夜；
16. 加入 50 μL 20mmol/L 碳酸氢铵 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；
17. 加入 5% 甲酸/50% 乙腈 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；
18. 如果需要用 Speed Vac. 浓缩多肽；
19. 用 ZipTip 脱盐和纯化多肽；
20. 如果需要用弱真空浓缩多肽至２ μL；
21. 加入基质进行质谱分析。
注意：根据细菌的生理和形态特征分类，产品来源为水解无色杆菌，但是最近细菌分类学将这种细菌鉴定为产酶溶杆菌。
保存：暗处－20℃保存
规格：20 μg×5 vial
相关产品
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 | 应用 |
| 202-15951 |
Trypsin, from Porcine Pancreas, Mass Spectrometry Grade 猪胰腺胰蛋白酶质谱级别 |
5×20 μg | 蛋白质组学 |
| 056-05921 | Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade 胞内蛋白酶 Asp-N（测序级别） |
2 μg | 用于测序 |
| 050-05941 | Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade 胞内蛋白酶 Glu-C（测序级别） |
50 μg | |
| 164-13982 | V8 Protease [Endoproteinase Glu-C] V8蛋白酶 |
2 mg | 生物化学 |
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赖氨酰肽链内切酶，MS级
产品编号：125-05061
发表文献
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[2] Leitner A et al. “Expanding the Chemical Cross-Linking Toolbox by the Use of Multiple Proteases and Enrichment by Size Exclusion Chromatography.”Molecular and Cellular Proteomics 11, no. 3 (March 1, 2012): M111.014126.
[3] Goetze A et al. “Rates and Impact of Human Antibody Glycation in Vivo.” Glycobiology 22, no. 2 (February 1, 2012): 221–234.
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| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 |
| 125-05061 | Lysyl Endopeptidase®, MS Grade 赖氨酰肽链内切酶，MS级 |
20 μg×5 | 质谱级 |
