实验方案

工作溶液配制

为了标记50 µg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL），请将5 µL（反应总体积的10％）反应缓冲液（组分B）与50 µL目标蛋白质溶液混合。
注意：如果蛋白质浓度不同，请相应地调整蛋白质体积，以使〜50 µg蛋白质可用于标记反应。
注意：要标记100 µg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL），请将10 µL（反应总体积的10％）反应缓冲液（组分B）与100 µL目标蛋白质溶液混合。
注意：蛋白质应溶于1X磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2-7.4；如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，则必须针对1X PBS（pH 7.2-7.4）进行透析，或使用10 kDa的Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜去除游离的胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）被广泛用于蛋白质沉淀。
注意：为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL，结合效率明显降低，低于1 mg / mL。 

操作步骤

1. 将蛋白质工作溶液（溶液A）添加到一个小瓶的标记染料（组分A）中，并通过将小瓶涡旋几秒钟将它们充分混合。
   注意：如果要标记100 µg的蛋白质，请使用两个小瓶（组分A），将100 µg的蛋白质分成2 x 50 µg的蛋白质，并使每个50 µg的蛋白质与一小瓶的标记染料反应。然后合并两个小瓶，用于下一步。
2. 将缀合反应混合物在室温下放置30-60分钟。
   注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。 

1. 将5 µL（对于50 µg蛋白质）或10 µL（对于100 µg蛋白质）添加到缀合反应混合物中，占TQ™染色猝灭缓冲液（组分C）总反应体积的10％；混合均匀。
2. 在室温下孵育10分钟。标记的蛋白（抗体）可以使用了。 

蛋白质缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5 mg / mL的浓度存储。为了更长的存储时间，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单份使用，并存储在≤–20°C下。

参考文献

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用于定量测定血清/血浆样品和细胞培养上清液中的人类载脂蛋白A1（apoA1）。请注意，洗涤，封闭和孵育缓冲液应包含清洁剂。吐温20，Triton X-100或NP40的使用浓度为0.05-0.5％。在封闭缓冲液和孵育缓冲液中，建议使用0.1％BSA，而不要使用牛血清，因为HDL 44也可以结合牛apoA1。

血清/血浆样品：分析人血清/血浆样品时，建议使用Apo ELISA缓冲液稀释样品，标准品和检测抗体。该缓冲液可防止可能由于人血浆和血清中常见的嗜异性抗体的干扰而引起的假阳性读数。apoB分析所必需的样品的Triton X处理不会干扰apoA1分析。建议将血清/血浆样品稀释150,000x至200,000x，请参见https://www.mabtech.com/knowledge-center/apodilution的稀释指南。避免重复冻融循环，不要将样品保存在-20°C下。储存在-20°C的样品会产生错误的高apoA1值。
注意：该试剂盒中未提供Apo ELISA缓冲液。

试剂：抗体是在含有叠氮化钠（0.02％）的无菌过滤（0.2μm）PBS中提供的。链霉亲和素-HRP用0.1M Tris缓冲液和0.002％Kathon CG提供。
标准范围：0.6-40 ng / ml

样品实验方案

储备溶液配制

通过将小瓶4内试剂重新溶于含1％BSA的1 ml PBS中来制备apoA1标准品，不要搅拌，在室温下放置15分钟，然后涡旋振荡3s。得到的储备液为4μg/ ml，应立即使用或以等分试样的形式储存在-20°C下，以备将来使用。我们建议等分试样在初次使用后不要重新冷冻。为了进行测试，请使用标准范围作为指导来准备原液的稀释液。

操作步骤

1. 通过添加100μl/孔，用mAb HDL 110涂覆高蛋白结合ELISA板，将其在pH 7.4的PBS中稀释至2μg/ ml。在4-8°C下孵育过夜。
2. 用PBS（200μl/孔）洗涤两次。
3. 通过添加200μl/孔的PBS和含有0.1％BSA（孵育缓冲液）的0.05％Tween 20来封闭板。在室温下孵育1小时。
4. 用含有0.05％Tween的PBS洗涤五次。
5. 通过将小瓶4重新溶于含1％BSA的1 ml PBS中来制备apoA1标准品，不要搅拌，在室温下放置15分钟，然后涡旋振荡3s。得到的储备液为4μg/ ml，应立即使用或以等分试样的形式储存在-20°C下，以备将来使用。我们建议等分试样在初次使用后不要重新冷冻。为了进行测试，请使用标准范围作为指导来准备原液的稀释液。
6. 加入100μl/孔的样品或在血清或血浆样品的孵育缓冲液或Apo ELISA缓冲液中稀释的标准液，并在室温下孵育1-2小时。血清/血浆样品的稀释建议可在以下网址找到：https：// www。mabtech.com/knowledge-center/apodilution。
7. 按照步骤4进行清洗。
8. 在孵育缓冲液或Apo ELISA缓冲液中添加100μl/孔的0.5μg/ ml mAb HDL 44-生物素用于血清/血浆样品。在室温下孵育1小时。
9. 按照步骤4进行清洗。
10. 在孵育缓冲液中以100：1 /孔的比例稀释1：1000的链霉亲和素HRP。在室温下孵育1小时。请注意，缓冲液中使用的叠氮化钠会抑制HRP活性。
11. 按照步骤4进行清洗。
12. 加入100μl/孔的适当底物溶液，如TMB。
13.  在适当时间的显影后，在ELISA读数器中测量光密度。