Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

解糖系/ミトコンドリア膜電位測定キット

• 1つのサンプルで2つの指標(乳酸産生量とミトコンドリア膜電位)を測定できる
• 誰でも簡単に実験ができるプロトコルを同梱
• 実験に必要な試薬が全て同梱されたオールインワンのキット

• 製品コード
  G272　 Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit

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マニュアル

検出原理

本キットは、細胞外へ排出される乳酸量をWSTホルマザンを用いた吸光度測定法にて測定し、ミトコンドリア膜電位をJC-1色素を用いた蛍光測定にて検出するキットです。これらの測定対象を同一サンプルから測定することで、代謝経路を評価することが可能です。
また、本キットではマイクロプレートを用いた測定が可能です。

Q

1キットあたり測定可能なサンプル数を教えて下さい。

A

下記表に記載のサンプル数を測定できます。
(Lactate Assay)

	予備実験を行わない場合	予備実験を行う場合
96 well プレート	48 well 分	39 well 分
測定可能なサンプル数 (n=3で行った場合)	16 サンプル	13 サンプル

※試料の乳酸濃度が未知の場合、1 mmol/l Lactate standard solutionの吸光度よりも低くなるように予備実験を行い希釈倍率を決定してください。取扱説明書「測定用サンプルの調製」をご参考ください。
※予備実験を行わない場合または予備実験を行う場合の最大測定可能サンプル数を記載しています。
※Lactate Assayを行う際、培地に血清を含む場合、バックグラウンドコントロールとして、使用した血清入り培地のみの測定試料を準備することをお勧めします。

Lactate Assayのプレートレイアウト例(n=3)
(左：予備実験なし、右：予備実験あり)

(JC-1 Assay)

	付着細胞				浮遊細胞
培養機器 (JC-1 添加量)	6 well (1 ml/well)	96 well (50 μl/well)	ibidi 8 well plate (100 µl/well)	35 mm dish (1 ml/well)	1.5 ml microtube (0.25 ml/tube)
測定可能 サンプル数	3 sample	20 sample (n=3で行う場合)	4 枚分	3 sample	15 sample

 ※本キットには、96穴マイクロプレート48 well分のJC-1 Assay用試薬が含まれます。

Q

本キットを用いてLactate AssayおよびJC-1 Assayを行うのにかかる時間を教えて下さい。

A

実験の流れ、各アッセイにかかる時間(目安)は下図の通りです。

Q

上清回収後、先にLactate Assayを行ってからJC-1 Assayを行うことは可能ですか。

A

先にLactate Assayを行った場合、刺激の条件によっては測定時間の差が結果に影響を及ぼす可能性があります。必ず、上清回収後は先にJC-1 Assayを行ってください。なお、細胞培養上清は冷凍(-20℃)で1ヶ月間保存可能です。

Q

[Lactate Assay]　450 nm以外の吸収フィルターで測定できますか。

A

450 nm以外では、490 nmのフィルターでの使用が可能です。ただし、吸光度値は450 nmで測定した場合と比較し低くなります。

Q

[Lactate Assay]　還元物質を含むサンプルは測定できますか。

A

サンプル中に還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色して正確なlactateの変化が測定できません。培地に、還元性を持つ薬剤等を添加して実験を行う場合、バックグラウンドコントロールとして「細胞を含まない培地＋薬剤のみ」の試薬ブランクを同時に評価し、サンプルの吸光度から試薬ブランクとして差し引いてください。

Q

[Lactate Assay]　Working solutionはどのくらい安定ですか。

A

Working solutionは保存できません。用時調製して下さい。また、光に不安定であるため、調製後は遮光して下さい。遮光下室温で4時間安定です。

Q

[Lactate Assay]　細胞培養上清サンプルは保存できますか。

A

冷凍(-20℃)で1ヶ月間保存可能です。

Q

[JC-1 Assay]　血清入り培地を使用してもいいですか。

A

細胞洗浄やJC-1 working solutionに血清入り培地を使用して頂いて構いません。蛍光観察時はImaging Buffer solutionの使用を推奨しますが、血清入り培地をご使用になる場合はフェノールレッド不含培地を推奨します。

Q

[JC-1 Assay]　染色後の細胞固定化、または細胞固定化後の染色は可能ですか。

A

固定化によりミトコンドリアが脱分極するため、染色後の固定及び固定化後の染色はできません。

Q

[Lactate Assay]　検出されたサンプルの吸光度の値が培地のみ(blank)の吸光度と変わりません。原因と解決策 を教えて下さい。

A

原因として、細胞から放出される乳酸量が少ないことが考えられます。まずは播種する細胞数を増やして頂くかインキュベート時間をさらに延ばして下さい。

Q

[JC-1 Assay]　赤と緑の両方の蛍光値が増加 (または減少)しました。結果をどのように解釈すればよいのでしょうか。

A

薬剤処理サンプルとコントロールの各々で赤色蛍光値/緑色蛍光値の比を算出して下さい。両者を比較して蛍光比が低い程ミトコンドリア膜電位が低下していると考えられます。

(赤/緑の比で評価する理由)

　JC-1は膜電位依存的に細胞に蓄積するため、細胞の状態により細胞あたりのJC-1の濃度は異なる場合があります^{1), 2)}(コントロールと薬剤処理サンプルでは細胞の状態が異なるため、JC-1の蓄積濃度が異なります)。

また、JC-1はミトコンドリア膜電位が高い状態では凝集し緑から赤色に蛍光がシフトします。この凝集体の量は膜電位の程度に依存する³⁾ことから、赤/緑の比でサンプル間のミトコンドリア膜電位を比較することができます。

 

〈参考文献〉

1) A. Cossarizza, et al., Biochem Biophys Res Commun., 1993, 197(1), 40.

2) A. Perelman, et al., Cell Death and Disease, 2012, 3, e430.

3) S. T. Smiley, et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 1991, 88, 3671.

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