MagCapture™ microRNA 分离试剂盒系列
本公司提供可实现从 Ago 免疫沉淀到RNA纯化一系列更简便操作的「microRNA Isolation Kit」系列产品。通过使用该系列产品，可便利地从人或小鼠的细胞、组织中回收 Ago 蛋白质结合 microRNA 以及目标 mRNA。另外，从培养上清、血清、血浆中也可回收游离状态的 Ago 蛋白质结合 microRNA。回收后的 RNA 可用于定量PCR、微阵列芯片（Microarray）、新一代序列分析等各种应用。该系列产品扩充至有采用了磁珠的 MagCapture™ microRNA Isolation Kit 和采用硅珠的，共８种试剂盒。
◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠型）
该系列有抗人 Ago2 抗体（4G8）、抗鼠 Ago2 抗体（2D4）、抗 Ago1-4 抗体（1G3）包被磁珠的三种试剂盒以及含有可固定任意抗体的 Protein G 磁珠试剂盒，共计４款产品。这些试剂盒都采用磁珠，可更方便地进行重复性良好的免疫沉淀操作。在免疫沉淀后的纯化 RNA 步骤中，采用能获得高纯度 RNA 的离心柱法；此外，也可以采用含有抗 Ago 抗体包被磁珠的３种试剂盒的更简便的一步法。
试剂盒内容（例：Human Ago2, 10次用）
● Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution——600 μL×1支
● Cell Lysis Solution——20 mL×1支
● Washing Solution for IP——40 mL×1支
● Elution Solution I for IP—— 500 μL×1支
● Elution Solution II for IP——500 μL×1支
● Binding Solution for Spin Column——2 mL×1支
● Binding Enhancer for Spin Column——100 μL×1支
● Washing Solution I for Spin Column——3 mL×1支
● Washing Solution II for Spin Column—— 4 mL×1支
● Elution Solution for Spin Column——1 mL×1支
● Spin Column/Collection Tube——10支
◆概述图
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产品名称
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使用抗体克隆号
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适应物种
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对应样本
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回收RNA
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IP B/F 分离
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RNA提纯
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MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2
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4G8
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人、猴、狗
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细胞/ 组织/血清/ 血浆
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microRNA 和目标mRNA
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磁力分离
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离心柱法、
一步法
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MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2
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2D4
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小鼠、大鼠、狗
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MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1-4
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1G3
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人、猴、狗,
小鼠、大鼠
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microRNA
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MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G
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随意
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参照抗体
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细胞/组织
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参照抗体
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离心柱法
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◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 实验案例（人）
从人细胞系中回收 microRNA
用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（银染色）确认通过本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2）从人K562细胞（1×107 cells）中获得的 microRNA（图1）。结果表明，使用本产品可获得高纯度的 microRNA。此外，通过定量 PCR 法（miR-92a 量），与使用原产品 microRNA Isolation Kit，Human Ago2 所获得的 microRNA 量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的 microRNA 回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的 microRNA 回收性能。
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| 图1. 银染色检测从人K562细胞纯化的 microRNA |
图2. 人K562细胞中纯化 microRNA 回收量的比较 |
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LaneM：标记
Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng
Lane2：本品（Spin Column法）
Lane3：本品（One Step法）
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从人血浆中回收结合游离 Ago 蛋白质的 microRNA
通过定量 PCR 法比较使用本产品和原产品从 200 μL 正常人混合血浆中获取的microRNA 量。结果显示，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA 回收量比原产品多。（见图３）
图３．人血浆中纯化 microRNA 回收量的比较
microRNA 的目标mRNA回收
向 miR-122 低表达的肝癌细胞株 HepG2 细胞（5×105 cells）中导入人工合成的 miR-122 和调节用荧光素酶 siRNA（Luc siRNA），使用本产品和原产品获得配制的 Ago2 IP RNA 以及用 ISOGEN® 配制的 total RNA。通过定量PCR法比较各RNA种所含 miR-122 的量（图４）和其目标mRNA（目标基因中 Aldo A mRNA 的量用 GAPDH mRNA 的量补充）。（图5）。结果表明，与原产品一样，通过本产品获得的目标 mRNA中，Aldo A mRNA 和 miR-122一同被浓缩，由此可知使用本产品可以获得 microRNA 的目标 mRNA。另一方面，使用 ISOGEN® 获得的 total RNA 中，Aldo A mRNA 随着 miR-122 的增加而逐渐分解减少。
图4.miR-122回收量的比较
图5.目标mRNA回收量的比较
◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 实验案例（小鼠）
从小鼠细胞中回收microRNA
用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染色）确认通过使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）从小鼠P388D1细胞（2×107 cells）中获得的 microRNA。（图1）结果表明，使用本产品可获得高纯度的microRNA。此外，通过定量PCR法（miR-92a量），与使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）所获得的microRNA量相比较可知（图2），本产品的离心柱法显示与原产品几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中显示出了比原产品更优秀的microRNA回收性能。
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图1．银染色检测从小鼠P388D1细胞纯化的microRNA
LaneM：标记
Lane1：合成RNA寡聚核苷酸（23base）1ng
Lane2：本品（Spin Column法）
Lane3：本品（One Step法）
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图2．小鼠P388D1细胞纯化microRNA回收量的比较
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从大鼠血浆中回收游离Ago2蛋白质结合microRNA
通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从 200 μL大鼠血浆中获取的microRNA量。结果表明，本产品的离心柱法与原产品具有几乎一样的microRNA回收性能；另外，在一步法中microRNA回收量比原产品大。（图3）
图3.人血浆中纯化microRNA回收量的比较
◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1-4 实验案例（人）
回收Ago1-4结合microRNA
分别使用 Ago1, Ago2, Ago3, Ago4特异性抗体对HeLa细胞中各RNA片段免疫沉淀处理后，进行微阵列芯片（3D-Gene® ，东丽）分析。结果表明miR-22和miR-16多数被Ago2抗体吸收。另一方面，miR-1260b, miR-4286多数被Ago1, Ago3, Ago4吸收。（表1）
基于此解析结果，验证使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4），是否可回收原产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2）中被Ago1, Ago3, Ago4吸收较为困难的microRNA。
表1. 微阵列芯片分析结果
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信号强度
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信号比
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Name
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Ago1 IP
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Ago2 IP
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Ago3 IP
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Ago4 IP
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Ago2/Ago1
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Ago2/Ago3
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Ago2/Ago4
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hsa-miR-22
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3521.4
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21696.5
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3771.2
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292.4
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6.16
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5.75
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74.20
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hsa-miR-16
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6886.3
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28527.2
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5013.4
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582.5
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4.14
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5.69
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48.97
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hsa-miR-1260b
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2060.3
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540.9
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1270.6
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1977.9
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0.26
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0.43
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0.27
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hsa-miR-4286
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678.8
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202.4
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2019.2
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471.2
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0.30
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0.10
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0.43
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图1.从HeLa细胞中回收的各microRNA量的比较
从人和小鼠细胞株中回收microRNA
通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品从人K562细胞（1×107 cells）和小鼠P388D1细胞（2×107 cells）中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图2、图3）
图2.人K562细胞中纯化microRNA回收量的比较 图3.小鼠P388D1细胞中纯化microRNA回收量的比较
从人和大鼠血浆中回收游离Ago结合microRNA
通过定量PCR法（miR-92a量）比较使用本产品和原产品（microRNAIsolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从人和大鼠血浆中中获取的microRNA量。结果表明，在同等条件下，使用本产品可获得更多的microRNA。（图4、图5）
图4.人血浆中纯化microRNA回收量的比较 图5.大鼠血浆中纯化microRNA回收量的比较
从各种动物细胞株中回收microRNA
通过定量PCR法（miR-92a量）测量使用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4从2×106 cells的K562细胞（人）、COS-7细胞（猴）、MDCK细胞（狗）、P388D1细胞（小鼠）、SCC-131细胞（大鼠）中获取的免疫沉淀RNA片段中microRNA量和使用ISOGEN® 从各种细胞中获取的total RNA片段中microRNA量。比较各免疫沉淀RNA片段中所含miR-92a 量和totalRNA片段中所含miR-92a量的相对值可知，本产品可在全部的细胞种类中获取microRNA。（图6）
图6.从各种细胞中获取的microRNA量的比较
◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G 实验案例
从人和小鼠细胞株中回收microRNA（与原产品的比较）
通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, ProteinG）和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）从人K562细胞（1×107 cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）获得的microRNA量（图1,2,3）。此外，通过定量PCR法（miR-92a量）比较在使用本产品和抗小鼠Ago2抗体（2D4）从小鼠P388D1细胞（2×107 cells）中获得的microRNA量以及使用原产品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）获得的microRNA量（图4）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，获得的microRNA量要比原产品多。
从人和小鼠细胞株中回收各种Ago蛋白质结合microRNA
通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago3抗体（1C12）、抗Ago4抗体（2G7)从人K562細胞（1×107cells）中获得的microRNA量（图5）。此外，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量PCR法（miR-92a量）研究在使用本产品和抗Ago1抗体（2A7）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗小鼠Ago3抗体（S09）、抗Ago4抗体（2G7)从小鼠P388D1细胞中获得的microRNA量（图6）。结果表明，本产品和任意抗Ago抗体组合使用，可获得各种Ago蛋白结合microRNA。
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图1. 抗Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较
本产品：使用抗Ago1抗体（2A7）
原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago1
（291-70201）
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图2. 人Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较
本产品：使用抗人Ago2抗体（4G8）
原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago2
（292-66701）
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图3. 人Ago3抗体固定时microRNA回收量的比较
本产品：使用抗人Ago3抗体（1C12）
原产品：microRNA Isolation Kit, Human Ago3
（297-70301）
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图4. 小鼠Ago2抗体固定时microRNA回收量的比较
本产品：使用抗小鼠Ago2抗体（2D4）
原产品：microRNA Isolation Kit, Human、Mouse Ago2
（292-67301）
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图5. 从人K562细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验
图6. 从小鼠P388D1细胞中纯化的microRNA回收量的比较和银染色检验
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