适用仪器

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样品实验方案

简要概述

1. 通过去除生长培养基制备细胞
2. 加入腔肠素装载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3. 在室温下孵育3-4小时
4. 检测水母发光蛋白的发光强度

溶液配制

储备溶液配制

1.腔肠素类似物：将250 µL 100％ETOH（组分B）加到腔肠素类似物（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：25 µL重组腔肠素类似物对于一块板就足够了。 如果将试管密封，则未使用的腔肠素类似物原液可在<-20℃下保存一个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：a）对于＃36305（10板试剂盒），准备使用1X分析缓冲液（组分C）。b）对于 ＃36306（100板试剂盒），通过将10 mL的10X分析缓冲液（组分C）稀释到90 mL的HHBS缓冲液（试剂盒中未提供）中，制成1X分析缓冲液，并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 将未使用的1X分析缓冲液存储在4℃下。

工作溶液配制

腔肠素装载溶液：将25 µL ETOH重构的腔肠素类似物（储备溶液制备）添加到10 mL 1X分析缓冲液（储备溶液制备）中，并充分混合。 注意：该工作溶液在室温下至少可稳定2小时，并避免光照。

实验步骤

1.从细胞板中去除生长培养基。 注意：重要的是去除生长培养基，以最大程度地减少化合物对血清或培养基的干扰。 注意：将细胞在含0.5-1％FBS的生长培养基中培养，以避免去除培养基的步骤。 在这种情况下，需要在1X缓冲液中装载2X腔肠素。

2.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的腔肠素加载溶液添加到细胞板中。

3.在避光的条件下，于室温下孵育腔肠素装载板3-4小时。

4.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。

5.通过使用具有光电倍增管的封闭腔室的光子检测系统，检测水母发光蛋白的发光强度。 仪器必须完全排除外部光线。

图示

图1. CHO-aeq细胞上的ATP剂量反应。 用载脂蛋白精稳定转染的CHO细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔接种在Costar白色96孔板中过夜。 除去生长培养基，并使用Screen Quest 腔肠素钙测定试剂盒将细胞与100 µL染料上载溶液一起在室温下孵育3小时，并避光。 由NOVOstar（BMG Labtech）添加ATP（25 µL /孔），以达到最终指示的浓度。 ATP的EC50约为0.8 µM。

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适用仪器

样品实验方案

简要概述

1. 通过去除生长培养基制备细胞
2. 加入腔肠素装载溶液（对于96孔板为100 µL /孔，对于384孔板为25 µL /孔）
3. 在室温下孵育3-4小时
4. 检测水母发光蛋白的发光强度

溶液配制

储备溶液配制

1.腔肠素类似物：将250 µL 100％ETOH（组分B）加到腔肠素类似物（组分A）的小瓶中，并充分混合。 注意：25 µL重组腔肠素类似物对于一块板就足够了。 如果将试管密封，则未使用的腔肠素类似物原液可在<-20℃下保存一个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

2.分析缓冲液（1X）：a）对于＃36305（10板试剂盒），准备使用1X分析缓冲液（组分C）。b）对于 ＃36306（100板试剂盒），通过将10 mL的10X分析缓冲液（组分C）稀释到90 mL的HHBS缓冲液（试剂盒中未提供）中，制成1X分析缓冲液，并充分混合。 注意：10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 将未使用的1X分析缓冲液存储在4℃下。

工作溶液配制

腔肠素装载溶液：将25 µL ETOH重构的腔肠素类似物（储备溶液制备）添加到10 mL 1X分析缓冲液（储备溶液制备）中，并充分混合。 注意：该工作溶液在室温下至少可稳定2小时，并避免光照。

实验步骤

1.从细胞板中去除生长培养基。 注意：重要的是去除生长培养基，以最大程度地减少化合物对血清或培养基的干扰。 注意：将细胞在含0.5-1％FBS的生长培养基中培养，以避免去除培养基的步骤。 在这种情况下，需要在1X缓冲液中装载2X腔肠素。

2.将100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的腔肠素加载溶液添加到细胞板中。

3.在避光的条件下，于室温下孵育腔肠素装载板3-4小时。

4.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。

5.通过使用具有光电倍增管的封闭腔室的光子检测系统，检测水母发光蛋白的发光强度。 仪器必须完全排除外部光线。

图示

图1. CHO-aeq细胞上的ATP剂量反应。 用载脂蛋白精稳定转染的CHO细胞以50,000个细胞/ 100 µL /孔接种在Costar白色96孔板中过夜。 除去生长培养基，并使用Screen Quest 腔肠素钙测定试剂盒将细胞与100 µL染料上载溶液一起在室温下孵育3小时，并避光。 由NOVOstar（BMG Labtech）添加ATP（25 µL /孔），以达到最终指示的浓度。 ATP的EC50约为0.8 µM。

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Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的钙检测试剂盒，钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的药物发现中的优选方法。 Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供均匀的荧光测定，用于检测细胞内钙动员。表达感兴趣的GPCR的细胞通过钙预先加载我们专有的Fluo-8 NW，其可以穿过细胞膜。 Fluo-8 NW是可用于HTS筛选的最亮钙指示剂。一旦进入细胞内，Fluo-8 NW的亲脂性阻断基团被非特异性细胞酯酶切割，产生带负电荷的荧光染料，其停留在细胞内，并且在与钙结合时其荧光大大增强。当用筛选化合物刺激细胞时，该受体表明细胞内钙的释放，这极大地增加了Fluo-8 NW的荧光。其长波长，高灵敏度和100-250倍荧光增加的特性（当它与钙形成复合物时）使Fluo-8 NW成为测量细胞钙的理想指标。这个Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供了一种优化的检测方法，用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒。 

点击查看光谱

样品实验方案

简要概述

1.准备细胞
2.去除生长培养基
3.添加Fluo-8 NW染料工作溶液
4.在室温下孵育1小时
5.监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

溶液配制

1.储存溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 Fluo-8 NW配制：
对于Cat No.36307，将10μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。
对于Cat No.36308和36309，将100μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。 注意：10μLFluo-8 NW原液足以容纳1个平板。

1.2分析缓冲液储备液（1X）：
对于Cat No.36307和36308，将9mL HHBS（组分C）加入10X Pluronic F127 Plus（1mL，组分B）中并充分混合。
对于Cat No.36309，将整瓶10XPluronic®F127Plus（10 mL，组分B）加入90 mL HHBS缓冲液（不包括在试剂盒中）中并充分混合。 注意：对于一个平板，10 mL的1X分析缓冲液就足够了。

2.工作溶液配制

将10μLFluo-8 NW DMSO储备溶液加入10mL 1X测定缓冲液中并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

操作步骤

1.有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

2.从细胞板上除去生长培养基。注意：重要的是去除生长培养基，以最大限度地减少背景荧光和化合物对血清或培养基的干扰。注意：或者，在含有0.5％至1％FBS的生长培养基中培养细胞，以避免培养基去除步骤。在这种情况下，需要在HHBS缓冲液中加入2X染料。 [我们为那些在生长培养基中使用0.5％至1％FBS以避免培养基去除步骤的人提供2个独立的无洗涤钙测定试剂盒（目录号36315和目录号36316）。

3.将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Fluo-8NW染料工作溶液加入到细胞板中。

4.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。注意：如果细胞在室温下运行时间较长，可在室温下孵育细胞培养板1-2小时（建议培养时间不超过2小时。）

5.用HHBS或所需缓冲液制备复合板。

6.通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来进行钙通量测定。注意：在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到最大强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的最大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU（Max-Min））用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算卡巴胆碱剂量样品。 

参考文献

2-OMe-lysophosphatidylcholine analogues are GPR119 ligands and activate insulin secretion from βTC-3 pancreatic cells: Evaluation of structure-dependent biological activity
Authors: Anna Drzazga, Agata Sowińska, Agnieszka Krzemińska, Andrzej Okruszek, Piotr Paneth, Maria Koziolkiewicz, Edyta Gendaszewska-Darmach
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