Extracellular OCR Plate Assay Kit

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Extracellular OCR Plate Assay Kit

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• ミトコンドリア関連
• 細胞内代謝

酸素消費速度プレートアッセイキット

• 細胞のOCRを汎用の蛍光プレートリーダーで測定できる
• 専用の装置や培地、プレートは不要
• 必要な試薬とOCR自動算出シートを準備

• 製品コード
  E297　 Extracellular OCR Plate Assay Kit

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マニュアル

キットの原理

Extracellular OCR Plate Assay Kitには、培地中の酸素濃度が低下するとりん光強度が高くなる特性を持つOxygen Probeと、空気中の酸素流入を遮断するためのMineral Oilを同梱しています。
細胞外の酸素濃度に応じたりん光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで測定後、Stern-Volmerの関係式より細胞のOCRを算出(自動計算シート)します。

※本製品は、群馬大学 吉原 利忠 先生のご指導の下、製品化しました。

Q

１キットあたりの測定可能なサンプル数の目安を教えてください。

A

1つの細胞種で同一細胞数にて実験する場合24サンプル測定可能です。

*２種類以上の細胞種や複数の細胞数を実験に用いる場合は、別途BlankとControlを準備する必要があり測定可能なサンプル数が変わります。詳細については、取扱説明書に実験系に応じたプレートレイアウトの例を記載しておりますのでご参照ください。
 

Q

浮遊細胞の実験例を教えてください。

A

Jurkat細胞の実験例をご案内します。
＜操作＞
(1)Blank 3としてJurkat細胞(3.0×10⁶ cells/ml)をRPMI培地に懸濁し、ControlやSampleとしてJurkat細胞(3.0×10⁶ cells/ml)をworking solutionに懸濁したものを用意し、96穴黒色クリアボトムマイクロプレートに100 µl (300,000 cells/well)ずつ播種した。
(2)Blank 1にはRPMI培地を100 µl、Blank 2にはworking solutionを100 µl添加した。
(3)予め37℃に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、30分間インキュベーションした。
(4)Blank 1, Blank 2, Blank 3, ControlにRPMI培地を10 µlずつ添加した。
(5)Sampleには、RPMI培地で希釈したSample solution(AntimycinもしくはFCCP溶液)を10 µlずつ添加した。
(6)Sample solution添加後は、直ちにMineral Oilを1滴ずつ各ウェルに滴下した。
(7)37℃に設定しておいたプレートリーダーの中にマイクロプレートを入れ、5分間インキュベーションした。
(8)蛍光プレートリーダーを用いて強度をタイムコースで10分毎に200分間測定した(Ex: 500 nm, Em: 650 nm, Bottomリーディング)。
(9)ダウンロードした専用の計算シートに得られた強度の値を入力し、OCR値を算出した。 

各ウェルに必要なサンプル及び試薬の添加量

＜結果＞

         
 

Q

本キットのOCR算出方法を教えてください。

A

専用の計算シートをダウンロードし、以下の手順でOCRを算出します。

＜OCR算出手順の概要＞

(1)OCR測定で得られた強度の値を計算シートに入力すると、Stern-Volmerの式より酸素量(nmol)が自動的に算出される。
(2)時間(min)と酸素量(nmol)のグラフより、測定した全ての条件において直線性の得られる範囲を確認する。
(3)2)で確認した時間(min)と酸素量(nmol)の範囲における傾きを算出する。
(4)3)で算出した傾きより、OCR(pmol/min)を算出する。
詳細は取扱説明書の"解析"をご参照ください。

Q

Mineral Oilに細胞毒性はありませんか。

A

Mineral oilを添加した細胞においてCell Counting Kit-8による細胞毒性測定を行ったところ、毒性は確認されませんでした。

(参考)

 

Q

OCR測定後の細胞数を計測する方法を教えてください。

A

核染色剤(Hoechst 33342)を用い、ウェルあたりの細胞数を算出した実験例をお示しします。

＜操作＞
(1)OCR測定用ウェルに細胞を播種した。
(2)段階希釈した細胞を検量線作成用ウェルに播種した。
(3)取扱説明書に従いOCRを測定した。
(4)検量線作成用ウェルに培地を10 µl/wellずつ添加した(液量をOCR測定用ウェルと110 µl/wellに揃えるため)。
(5)培地で希釈したHoechst 33342溶液(10 µg/ml)を全てのウェルに100 µl/wellずつ添加した。
 ※OCR測定用ウェルはオイル上から添加した。
(6)37℃、30分間インキュベートした。
(7)蛍光プレートリーダーにて測定した(Ex: 350 nm , Em: 461 nm )。
(8)検量線(X軸：細胞数、Y軸：蛍光強度)を作成し、OCR測定用ウェルの細胞数を算出した。

Q

Working solutionは保存できますか。

A

working solutionは保存できません。用時調製してください。

Q

Oxygen ProbeやMineral Oilは凍結融解を繰り返しても測定に影響しませんか。

A

 Oxygen ProbeおよびMineral Oilは凍結融解を繰り返した場合も測定に影響がないことを確認しています。

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