上海金畔生物科技有限公司代理Takara酶试剂盒全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息。
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| ■ 制品内容 (10 次量) |
| □ Package1 (-20℃保存) |
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| RNase Inhibitor (40 U/μl) |
50 μl |
| 10X BAP Buffer |
200 μl |
| Alkaline Phosphatase (BAP) (0.4 U/μl) |
20 μl |
| 0.1%BSA |
60 μl |
| 3’Adaptor*1*2 |
10 μl |
| T4 RNA Ligation Buffer |
600 μl |
| T4 RNA Ligase (40 U/μl) |
20 μl |
| 5X T4 PNK Buffer |
100 μl |
| T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK) (10 U/μl) |
10 μl |
| 5’Adaptor*1 |
10 μl |
| 5X RT Buffer |
40 μl |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) |
90 μl |
| PCR-R & RT-Primer (50 pmol/μl)*1*3 |
20 μl |
| RTase (RNaseH free) (200 U/μl) |
10 μl |
| 2X PCR Buffer |
250 μl |
| PCR Primer F (50 pmol/μl)*1 |
10 μl |
| TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl) |
10 μl |
| Control RNA (5 pmol/μl)*4 |
10 μl |
| □ Package2 (4℃保存) |
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| 3M Sodium Acetate (pH 5.2) |
200 μl |
| Dr.GenTLE Precipitation Carrier*5 |
80 μl |
| 2X B/W Buffer |
2.7 ml |
| Magnosphere™ MS300/Streptavidin |
100 μl |
| RNase free dH2O |
10 ml |
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| *1 3’Adaptor、5’Adaptor、PCR Primer F及PCR-R、RT-Primer上都带有Sse8387Ⅰ酶切位点，使用Sse8387Ⅰ酶切后的PCR产物可以与Pst I酶切的载体进行连接克隆。本试剂盒中不备有限制酶和克隆用载体，请另外准备。 |
| *2 3’Adaptor已用生物素标记。 |
| *3 PCR用的Reverse Primer，也可以作为反转录引物使用。 |
| *4 Control RNA是一条21mer、5’端磷酸化的RNA。 |
| *5 Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094)。 |
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| ■ 制品说明 |
近几年的研究表明，在细胞内发现的RNA中有许多是非编码RNA，它们有着重要的功能，这些RNA被称为功能性RNA，其中倍受关注的是18-26 个碱基的低分子RNA，这些低分子RNA的功能有：
① mRNA水平抑制基因表达。
② 翻译水平抑制基因表达。
克隆是分析小RNA的有效方法之一。由于小RNA与mRNA不同，它不具有PolyA tail，因此，在克隆时，需在小RNA的5’端和3’端分别加上RNA接头或者RNA/DNA杂合形式的接头，经RT-PCR后进行PCR。
本试剂盒主要用于cDNA的合成和小RNA的克隆。
试剂盒通过简单的磁珠吸附操作即可纯化小RNA反转录得到的cDNA，省去了在接头连接之后切胶回收等复杂操作步骤。扩增得到的cDNA可以直接用于TA克隆，或者利用接头中带有的酶切位点进行克隆。
使用本试剂盒对小RNA (Small RNA) 进行克隆时的操作流程见图1。起始的Small RNA是由总RNA 经过电泳及切胶回收得到的。详细步骤如下：
1. 将Small RNA进行BAP处理，5’端去磷酸化。
2. 将带有生物素标记的RNA/DNA杂合形式的接头与BAP处理后的Small RNA的3’端进行连接。
3. 用标记Streptoavidin的磁珠，回收带有生物素标记接头的Small RNA，然后进行5’端磷酸化反应。
4. 将5’端连接上RNA/DNA嵌合的接头后，使用RT Primer和反转录酶进行反转录反应。
5. 从磁珠上回收合成的cDNA后，进行PCR反应。
6. PCR片段克隆。 |
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| ■ 各种引物及Control RNA的碱基序列 |
| 名 称 |
切 点 |
酶 例 |
| PCR-R & RT-Primer |
| 5’-GTCTCTAG |
CCTGCAGG |
ATCGATG-3’ |
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反转录反应及PCR反应的Reverse引物，含有Sse8387Ⅰ的识别序列 (阴影部分)。 |
| PCR-Primer F |
| 5’-AAAGAT |
CCTGCAGG |
TGCGTCA-3’ |
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PCR反应的Forward引物，含有Sse8387Ⅰ的识别序列 (阴影部分)。 |
| Control RNA |
5’p-AGAUGACGGCAACUACAAGAC-3’ |
用于Control反应。 |
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| ■ small RNA克隆流程图 |
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页面更新：2021-04-19 10:45:43
