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NAD/NADH Assay Kit-WST

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

NAD/NADH Assay Kit-WST

細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
細胞機能解析
細胞内代謝

NAD/NADH 測定キット

製品コード

N509　 NAD/NADH Assay Kit-WST

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
100 tests	￥55,800	347-09321

キット内容

100 tests	・NAD/NADH Extraction Buffer ・NAD/NADH Control Buffer ・Standard Buffer ・Assay Buffer ・Dye Mixture ・Enzyme ・Standard ・Filtration Tube	20 ml×1 20 ml×1 10 ml×1 5.5 ml×1 550 μl×1 x1 x1 x12

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技術情報

NAD⁺とNADHの測り分け操作

本キットに含まれる抽出バッファーと、除タンパク質用チューブを用いて簡便に培養細胞から細胞ライセートを調製できます。また細胞ライセートを加熱処理することで、細胞内 NADH量のみを定量することができ、別途測定した総 NAD⁺/NADH 量からNADH 量を差し引くことで、細胞内 NAD⁺量を求めることができます。

NAD/NADH 測定キット NAD/NADH Assay Kit-WST　同仁化学研究所

本キットではn=3で12サンプルと標準サンプル8点の測定が可能です。12サンプル以上を使用する際には、別途フィルトレーションチューブをご準備頂く必要があります。

技術や使用製品に関する補足

学会発表ポスター

WSTを用いた細胞の代謝解析

NAD/NADH 測定キット NAD/NADH Assay Kit-WST　同仁化学研究所

参考文献

参考文献を表示する

文献No.	対象サンプル	引用（リンク）
1)	オルガノイド（老齢マウス腸上皮オルガノイド）	R. Uchida, Y. Saito, K. Nogami, Y. Kajiyama, Y. Suzuki, Y. Kawase, T. Nakaoka, T. Muramatsu, M. Kimura and H. Saito , "Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging", NPJ Aging Mech Dis., 2018,doi：10.1038/s41514-018-0031-5.
2)	細胞（成人 T 細胞白血病細胞株）	T. Kozako, A. Aikawa, T. Ohsugi, Y. Uchida, N. Kato, K. Sato, K. Ishitsuka, M. Yoshimitsu and S. Honda, "High expression of NAMPT in adult T-cell leukemia/lymphoma and anti-tumor activity of a NAMPT inhibitor', Eur. J. Pharmacol.., 2019, 865, 172738.
3)	細胞（Sirt 7ノックアウト線維芽細胞）	S. U. Sobuz, Y. Sato, T. Yoshizawa, F. Karim, K. Ono, T. Sawa, Y. Miyamoto, M. Oka and K. Yamagata, "SIRT7 regulates the nuclear export of NF-κB p65 by deacetylating Ran.', Biochim Biophys Acta Mol Cell Res.., 2019, 1866(9), 1355.
4)	細胞（ヒトiPS由来神経細胞）	K. Hayakawa, K. Nishitani and S. Tanaka, "Kynurenine, 3-OH-kynurenine, and anthranilate are nutrient metabolites that alter H3K4 trimethylation and H2AS40 O-GlcNAcylation at hypothalamus-related loci.", Sci Rep, 2019, 9(1), 19768.
5)	細胞（HuH-7）	M. Mikeli, M. Fujikawa, K. Nagahisa, S. Yasuda, N. Yamada and T. Tanabe, "Contribution of GPD2/mGPDH to an alternative respiratory chain of the mitochondrial energy metabolism and the stemness in CD133-positive HuH-7 cells.", Genes Cells, 2020, 25(2), 139.
6)	細胞（HeLa）	J.Thapaa, K. Hashimoto, S. Sugawara, R. Tsujikawa, T. Okubo, S. Nakamura and H.Yamaguchi, "Hypoxia promotes Chlamydia trachomatis L2/434/Bu growth in immortal human epithelial cells via activation of the PI3K-AKT pathway and maintenance of a balanced NAD⁺/NADH ratio", Microbes Infect., 2020, DOI:10.1016/j.micinf.2020.04.010.

よくある質問

Q 1キットで測定可能なサンプル数は？

全てのサンプルをn:3で測定した際のサンプル数の目安は下記の通りです。

	『NAD⁺とNADHの総量』または『NADH量』の何れかを測定する場合	『NAD⁺とNADHの総量』および『NADH量』の両方を測定する場合
サンプル数	24サンプル	12サンプル

　※標準サンプルを2 μmol/Lから段階希釈し、計8点(n:3)で検量線を1回作成した際に測定可能な実サンプル数を記載。
　　測定を2回に分けて行う場合は、別途検量線を作成する必要があるため上記サンプル数よりも少なくなります。

Q 450 nm以外の吸収フィルターで測定できますか?: A

450 nm以外では、490 nmのフィルターでの使用が可能です。

ただし、吸光度値は450 nmで測定した場合と比較し低くなります。

それぞれの吸収フィルターで測定した時の検量線は下記の通りです。

Q Filtration Tube（除タンパク質用）は別途購入できますか？: A

ご不便おかけしますが、Filtration Tubeのみの販売は行っておりません。

小社にて実績のある市販の除タンパク質用チューブをご紹介いたします。

製造メーカー：Pall Corporation

製品名：ナノセップ遠心ろ過デバイス（分画分子量：10K、色：ブルー）

Q Working solutionはどのくらい安定ですか?: A

Working solutionは保存できません。用時調製して下さい。また、光に対して不安定なため

溶液調製後は遮光して下さい。遮光、室温で4時間安定です。

Q サンプルが発色しない原因はありますか？: A

測定試料中に含まれているNAD量が、本キットで定量可能な濃度以下となっている可能性があります。

その場合は細胞数を増やして頂くか、測定試料を希釈している場合は、希釈倍率を下げて測定して下さい。

Q 組織を用いた実験例はありますか？: A

マウス肝臓組織を用いてNAD/NADHおよびATPを測定した事例がございます。
実験操作の詳細は下記をご参照ください。

アルカリ抽出法による肝臓サンプルからの代謝指標の抽出
1. マウス肝臓100 mgあたり500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液を入れる。
　*使用する組織は必ず灌流操作等で十分に脱血してください。血液の残存は測定に影響を与えます。

2. ダウンス型ホモジナイザーで組織を破砕する。
　*氷浴上で行ってください。

3. サンプルを回収し、サンプルチューブに移す。破砕に使用した容器を500 µlの冷えた0.5 mol/l KOH水溶液で共洗いし、チューブ内のサンプルと合わせる。（全量 1 ml）

4. 冷えた超純水 1 mlをサンプルチューブに加え、よく混合し氷上で5分間静置する。（全量 2 ml）
　*溶液の粘性が高いと、次操作の遠心後の分離が困難になる場合があります。その際は、シリンジに25 G(針のゲージ数)程度の細い針を付け、サンプル溶液をシリンジでスムーズに出し入れができるまで(20-30回)混合してください。

5. 12,000 x g , 4℃で5分間遠心し、上清を900 µlずつ二つのサンプルチューブに回収する。
　*１本をNAD/NADH測定、もう１本をATP測定に使用。NAD/NADHのみを測定する場合は900 μlx1本のみで構いません。

NAD/NADH測定用サンプルの調製
*取扱説明書の1. 測定用サンプルの調製の(5)から行う。
*希釈用溶液として0.5 mol/l KOH水溶液と1 mol/l KH₂PO₄水溶液を9:5の比率で混合したものを準備しておく。

6. 上記5. で調製したサンプルのうち450 µlをMWCO 10Kフィルトレーションチューブに移し、 15,000 x gで20分間遠心する。
　*遠心後の溶液が200 µl以上ない場合は遠心時間を延長してください。

7. 得られた濾液を、1.5 ml マイクロチューブ2 本に100 μl ずつ移し、総NAD⁺/NADH 量およびNADH 量測定試料とする。

8. NADH 量測定試料を60 ℃ で60 分間インキュベートし、測定サンプルを室温まで冷却する。

9. 調製後の総NAD⁺/NADH 量およびNADH 量測定試料が入ったチューブそれぞれに、22 µlの1 mol/l KH₂PO₄水溶液を入れて中和後、78 µlの希釈用溶液（KOHとKH₂PO₄の混合溶液)を加えてよく混合し、測定用サンプルとする（total 200 µl）。

<測定時の注意点>
*操作5、7で得たサンプルは保存できません。その日のうちに測定してください。
*スタンダード、サンプルの希釈には希釈用溶液として0.5 mol/l KOH水溶液と1 mol/l KH₂PO₄水溶液を9:5の比率で混合したものを使用してください。

＜測定例＞
NASH誘導マウス肝臓組織におけるNAD量の変化