人ES/iPS细胞检测试剂盒

可检测未分化细胞数

rBC2LCN（AiLecS1）来源于Burkholderia cenocepacia，凝集素 BC2L-C 的N末端域在大肠菌表达的重组蛋白。 　　rBC2LCN 对人类ES/ iPS细胞表面足糖萼蛋白的粘蛋白O-型糖链-H-3型（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和性，因此 rBC2LCN 被认为是可以检测人类ES/ iPS细胞的未分化标志物。 　　通过 rBC2LCN 把糖蛋白（H-3 型聚合足糖萼）从人类ES/iPS细胞表面释放到培养液中。该试剂盒通过rBC2LCN和未分化标记抗体的 Sandwich Assay 测定法，定量测定从人类ES/iPS细胞表面释放到培养中的糖蛋白数量，进而可推算出人类ES/iPS细胞数。

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50 μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

　试剂盒构成

构成品品名	容量×数量
rBC2LCN固相检测板	96 well×1板
HRP标识抗体溶液	400 μL×1支
阴性对照品	1 mL×1支
阳性对照品	100 μL×1支
稀释溶液	15 mL×1支
清洗液（10×）	100 mL×1支
TMB溶液	10 mL×1支
显色停止液	10 mL×1支
封板贴	4片

◆原理

　●标准曲线制作

　　该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

　　　1.　在未分化维持培养条件下进行人ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养上清。

　　　2.　细胞剥离，测定人S/ iPS细胞数。

　　　3.　计算出回收到的培养上清中所含的人ES/ iPS细胞数。如：培养基量 5 mL，测定细胞数为 5×10⁶ cells 时，则回收培养上清中的

　　　　　人ES/ iPS细胞数即为 1×10⁶ cells/mL。

　　　4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准曲线。

◆分化诱导时的使用案例

　　　1.　在未分化维持培养时，对人ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人ES/iPS细胞数。

　　　2.　在分化用培养基中对第１项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

　　　3.　使用本试剂盒测定可确认人ES/iPS细胞数的培养上清。

　　　4.　推算分化条件下残存的人ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　　用 StemSure^® hPSC 培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在 StemSure^® hPSC 培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类iPS细胞检测下限值^※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×10⁴ cells/mL：总细胞数 1×10⁵ cells/mL）的人iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养上清中测定出人iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人iPS细胞的检测下限值^※，分别为：170 cells/mL 和 96 cells/mL。

　使用注意项

　　●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞株、未分化维持培养条

　　　  件、分化诱导培养基标准曲线。

　　●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

　　●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也是需要参考的指标之一。

欲了解更多相关资料请点击文字：无损监测具有致瘤性人ES/iPS细胞的技术

说明书.pdf

人类ES/iPS细胞测定试剂盒单页_1606WAAU01.pdf

◆相关产品

●荧光标识rBC2LCN
　　添加到人类ES/iPS细胞培养液中，可为人类ES/iPS活细胞染色。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-02991	rBC2LCN-FITC【AiLecS1-FITC】 Ex.495 nm,Em.520 nm	细胞染色用	100 μL
186-02993			100 μL×5
186-03211	rBC2LCN-547【AiLecS1-547】 Ex.551nm,Em.565nm	细胞染色用	100 μL
182-03213			100 μL×5
185-03161	rBC2LCN-635【AiLecS1-635】 Ex.634 nm,Em.654 nm	细胞染色用	100 μL
181-03163			100 μL×5

●rBC2LCN-PE23
　　仅加入含有人类ES/ iPS细胞的培养液中，可以选择性地杀死人类ES/ iPS细胞。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
180-03231	rBC2LCN-PE23	细胞培养用	100 μL
186-03233			100 μL×5

●rBC2LCN汽提溶液
　　可将与人类ES/ iPS细胞表面糖链聚合起来的rBC2LCN从细胞上剥落下来。rBC2LCN剥落后，细胞还可添加其他抗体进行染色、培养。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
182-03171	rBC2LCN Stripping Solution【AiWashS1】	细胞培养用	10 mL

●BC2LCN凝聚素, 重组体、溶液
　　集中未标识的rBC2LCN

生产编号	品名	规格	容　量	保存温度·法规
029-18061	BC2LCN【AiLecS1】Lectin,recombinant, Solution	糖链研究用	1 mg
025-18063			1 mg×5

●StemSure^® hPSC培养基Δ
　　无饲养层细胞条件下可用于维持培养人类ES/iPS细胞的无血清液态培养基。原料不含动物体成分。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-17571	StemSure® hPSC Medium Δ	细胞培养用	100 mL
193-17573			100 mL×4
064-05381	Fibloblast Growth Factor (basic),Human,   recombinant, Animal-derived-free 【bFGF/FGF2】	细胞生物学用	50 μg
068-05384			100 μg
060-05383			1 mg
160-27051	hPSC Dissociation Solution 人类iPS細胞用单体细胞分散剂。不含酶、动物体来源材料。	细胞培养用	100 mL

●StemSure^®系列
　　通过小鼠ES细胞D3株或人类iPS细胞201B7株，进行品质测验。

产品编号	品名	规格	容量	保存温度·法规
197-16275	StemSure® D-MEM with Phenol Red and Sodium   Pyruvate	细胞培养用	500 mL
197-16775	StemSure® Serum Replacement	细胞培养用	500 mL
198-15781	StemSure® 10mmol/l 2-Mercaptoethanol Solution（×100）	细胞培养用	100 mL
195-15791	StemSure® 50mmol/l Monothioglycerol Solution（×100） 可与2ME同等使用的还原剂。医药用外不适用。	细胞培养用	100 mL
190-15805	StemSure® 0.1w/v% Gelatin Solution	细胞培养用	500 mL
195-16031	StemSure® Freezing Medium 含有BSA的ES细胞・iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100 mL
197-17831	StemSure® hPSC Freezing Medium, AF 无动物体成分的人类ES·iPS细胞用冻存液	细胞培养用	100 mL
199-16051	StemSure® LIF,Mouse,recombinant,Solution	细胞培养用	106 units
195-16053			106 units×10

●Y-27632, MF
　　该品作为培养基添加物被登记在原药等登录原簿（MF）中。以自主规格为基础，实现原料管理、制造工程和分析实验的有效检验，创建可以恒常稳定产品品质的体制。＜点击此处＞

●ES・iPS细胞研究用试剂
　　2007年iPS细胞确立发表后，许多与iPS细胞相关的文献纷纷发表。在各种各样的文献中报道出来的与ES细胞・iPS细胞的未分化功能维持和分化诱导相关的低分子化合物也逐渐阵容化。＜点击此处＞

●液态培养基・细胞培养用试剂
　　我们有着以液态培养基为首的平衡盐溶液、细胞剥离·分散液、抗生物质溶液、细胞外基质等丰富的产品种类。＜点击此处＞

Q：　培养上清中会有糖萼蛋白残留吗？

A：　糖萼蛋白会被释放到培养上清中。培养上清在37℃条件下保存８天，信号都不会减弱，因此作为本试剂盒测试对象的糖萼蛋白上的糖链

         在此期间都能保持其稳定性。如果冷冻保存的情况下，糖链安定性可稳定维持４个月。（但切记避免反复冻融。）

Q：　糖萼蛋白可作为标准品使用吗？

A：　该试剂盒是用于检测糖萼上的糖链的。因合成附有糖链的蛋白质很困难，所以生产出试剂盒适用的标准品也不易。虽然可能可以制作出不

         带糖链的糖萼蛋白，但是否能够作为标准品就不得而知了。

Q：　释放的足糖萼蛋白长度是恒定的吗？

A：　足糖萼蛋白是氨基酸配列恒定的，分子量为 55 kDa 的蛋白质，但实际上足糖萼蛋白上还附有Ｏ型糖链、N型糖链和葡糖胺聚糖，分子量

         为240 kDa 以上的大型粘蛋白分子。因是由糖链修饰程度和性质不同的分子群混合起来的异质糖蛋白质群，分子量并不是恒定的。

         电泳分子量＞240kDa。

Q：　在三维细胞培养中，足糖萼蛋白也能释放出来吗？

A：　是的，三维培养中也能释放足糖萼蛋白。

Q：　足糖萼蛋白的作用是什么？

A：　足糖萼蛋白在人类iPS细胞中的机能暂时未知，但和未分化细胞的形态、增值性、分化能等有着密切的关系。它是发现肾脏肾小球足细胞的

         主要糖蛋白，在足细胞形态的形成和足细胞机能中起重作用。足糖萼蛋白缺失的小鼠，会引起肾脏异常致死。

Q：　回收培养上清时，是否需要进行混匀？

A：　是的。摇晃孔盘/孔板轻轻混匀后，再进行培养上清的回收。

Q：　阳性对照品和阴性对照品的使用目的是什么？

A：　用以确认试剂盒反应系是否正常进行。

Tateno, H., Onuma, Y., Ito, Y., Hiemori, K., Aiki, Y., Shimizu, M., Higuchi, K., Fukuda, M., Warashina, M., Honda, S., Asashima, M. and Hirabayashi, J.: Sci. Rep., 4, 4069 (2014).