ScreenFect A+

DNA & siRNA 转染试剂！

◆原理

　　ScreenFect ™A+是通过点击化学（Click Chemistry）方法筛选出的阳离子脂质体转染试剂。适用于各种真核细胞，也可直接添加到含有抗生素或者血清的培养基中。使用 ScreenFect ™A+转染试剂可将 DNA 和 siRNA 转入常见实验室培养的细胞株（HeLa、HepG2、MDCK 等）、干细胞（小鼠ES细胞等），血液细胞（巨噬细胞、THP-1、RAW264 等），小胶质细胞和原代细胞。由于低细胞毒性，不含有任何有毒有害成分，转染后无需更换培养基。

※1 Biomaterials. 2012 Nov; 33(32):8160-6. 2012

◆优点、特色

●　DNA 用量少。

●　高效一步转染法。

●　转染效率高＆细胞毒性低。

●　使用成本低

◆案例、应用

【ScreenFect ™ A+ 转染性能（流式细胞仪检测）】

用于不同细胞的高效脂质体转染试剂!!

用于不同细胞的高效脂质体转染法!!

适用于难转染的悬浮细胞!!

一步法和两步法实验流程的比较

产品名称	ScreenFect ™ A plus	Ａ厂家新产品 （+试剂）	Ａ厂家产品
推荐的实验流程	一步法	两步法
实验用时	２天	３天
所需DNA量	低	高
细胞数目调整	灵活 （细胞准备仅在转染之前）	不灵活 （取决于细胞预培养条件）
胰酶消化	需要 （仅在转染之前）	需要 （在细胞预培养之前）
适于高通量筛选	+++++	+
培养基的更换	取决于细胞系

一步法比两步法节省24小时！

ScreenA+.pdf

高性价比的高性能基因导入试剂

ScreenFect ™ 通信

基因导入人 iPS 细胞实验数据

　　介绍使用 ScreenFect ™A plus 将基因导入人iPS细胞的实验结果和操作步骤。本文记载了作为 iPS 细胞支架使用的 Matrigel 孔板包被方法、配制含有 Y-27632 的细胞悬浮液的操作步骤以及最优的试剂比例，供您参考。

 

◆导入人iPS细胞（201B7株）的转染操作实例

　　在这里，我们将介绍一些使用 StemSure^® hPSC 培养基Δ（产品编号：197-17571）的操作实例。该操作步骤的完整版和使用 mTeSR1 培养基的操作步骤，请查看 FUJIFILM Wako 公司的官网。http://db.screenfect.jp/ja/documents/list/protocol

 

<转染试剂的配制>

将 2.0 μL 的 ScreenFect ™ A plus reagent、4.0 μg 的质粒 DNA 加入到 160 μL 的 Opti-MEM 中制成 DNA-lipid complex。

 

< Matrigel 包被孔板>

1.  ４°C下溶解 Matrigel hESC-Qualified Matrix 。为防止发生凝固，请避免在室温下溶解。

2.  用 25 mL 冷却的 D-MEM/Ham's F-12 稀释 300μL 的 Matrigel。

3.  稀释后的 Matrigel 溶液按照 1 mL/well 加入到 12 孔板中。

4.  在室温下孵育１小时以上。

 

<细胞悬液的配制>

1.  将 StemSure^® hPSC 培养基Δ在 2-8℃ 下放置数小时或过夜缓慢融解。不要在 37° C下解冻，并在一周内使用。

2.  将 bFGF（产品编号：064-05381,068-05384）按照终浓度 35-100ng/mL 添加到融解后的 StemSure^® hPSC 培养基△中，配制成完全培养基（以下称为 sshPSC 培养基）。

3.  使用前将 sshPSC 培养基恢复至室温。不要使用温水浴。

4.  将 Y-27632 按照终浓度 10 μmol/L 添加到 sshPSC 培养基中（以下称为 ROCKi+培养基）。

5.  去除 hiPS 细胞培养孔板中的培养基，用 PBS（-）清洗细胞一次。

*请在细胞汇片达到80％且处于对数增殖期时进行细胞转染。

6.  除去 PBS（-），添加 Stempro Accutase。

7.  在 37°C，5％CO₂ 培养箱中静置５分钟。

8.  用 1 mL 微量移液枪添加 ROCKi+培养基，将细胞从培养板上分离并吹散成单细胞。

9.  转移至 15 mL离心管中。

10. 室温下 1000 rpm（约170×g）离心３分钟。

11. 去除上清，用ROCKi+培养基重悬细胞。

12. 计算活细胞的数量。

13. 用 ROCKi+培养基将细胞浓度调整至 5×10⁵ cells/mL。

 

<转染>

添加 1 mL 配制好的 DNA-lipid complex 到细胞悬液中，使用移液器充分混匀，并接种在 12 孔板中。

※要点

接种 24 小时后请更换培养基。此时的培养基不需要含有 Y-27632。

 

◆实验数据

　　通过反向转染（1-STEP）将 GFP 融合基因导入 hiPS 细胞（201B7株），并通过荧光显微镜比较基因的导入效率。

 

<StemSure^® hPSC 培养基Δ的使用>

细胞数：5×10⁵ cells/well

质粒 DNA 量：4 μg/assay

转染试剂混合比例：DNA 量（μg）：ScreenFect ™ A plus reagent (μL)=1 : 0.5

容器：12 孔板

备注：用 Opti-MEM 稀释 ScreenFect ™ A plus reagent 和 DNA。

 

<mTeSR1 培养基的使用>

细胞数：5 x 10⁵ cells/well

质粒 DNA 量：1 μg/assay

转染试剂混合比例：DNA数量（μg）：ScreenFect ™ A plus reagent (μL)=1 : 2

容器：12 孔板

备注：用 Opti-MEM 稀释 ScreenFect ™ A plus reagent 和 DNA。

 

◆使用上的注意

●　建议在单细胞状态下进行人iPS细胞的基因导入。

●　建议基因导入时的细胞数约为 5×10⁵ cells/well。

●　当质粒 DNA 量多时，导入基因的表达量高会引起细胞死亡。

◆产品列表

产品编号	产品名称	规格	包装
293-77101	ScreenFect ™ A plus	基因研究用	0.2 mL
299-77103			1 mL
297-77104			1 mL×5

[1]	Diefenbacher, Markus E., et al. "The LIM Domain Protein nTRIP6 Recruits the Mediator Complex to AP-1-Regulated Promoters." PLoS ONE 9.5 (2014): e97549.
[2]	Freise, Christian, and Uwe Querfeld. "Inhibition of vascular calcification by block of intermediate conductance calcium-activated potassium channels with TRAM-34." Pharmacological Research (2014).
[3]	Hagiwara, Akane, et al. "Luteinizing Hormone-Induced Expression of Ptger4b, a Prostaglandin E2 Receptor Indispensable for Ovulation of the Medaka Oryzias latipes, Is Regulated by a Genomic Mechanism Involving Nuclear Progestin Receptor."
[4]	Peng, Yanyan, Ruidan Xu, and Xiaofeng Zheng. "HSCARG Negatively Regulates the Cellular Antiviral RIG-I Like Receptor Signaling Pathway by Inhibiting TRAF3 Ubiquitination via Recruiting OTUB1." PLoS pathogens 10.4 (2014): e1004041. (3)
[5]	Wakimoto, Hiroaki, et al. "Targetable signaling pathway mutations are associated with malignant phenotype in IDH-mutant gliomas." Clinical Cancer Research (2014). (2)
[6]	Fischer, Simon, et al. "Breaking limitations of complex culture media: Functional non-viral miRNA delivery into pharmaceutical production cell lines." Journal of biotechnology 168.4 (2013): 589-600.
[7]	Bai, Dongmei, et al. "Regulation of the HDM2-p53 pathway by ribosomal protein L6 in response to ribosomal stress." Nucleic acids research 42.3 (2014): 1799-1811.
[8]	Liu, Xing, et al. "Isocitrate dehydrogenase 2 mutation is a frequent event in osteosarcoma detected by a multi‐specific monoclonal antibody MsMab‐1." Cancer medicine 2.6 (2013): 803-814.