愈创木酚检测试剂盒

Guaiacol Detection Kit

◆背景

 

嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidoterrestris 是革兰氏阳性，产芽胞厌氧菌，在自然界中普遍存在。1984年透明苹果汁混浊事件后该物种被大量研究。生长在相对高的温度和酸性条件下的Alicyclobacillus 类细菌，称为热-嗜酸性杆菌（TAB） [1, 2, 3]. TAB 不能通过巴氏消毒法被灭菌，可能残留在合成的食物和饮料中。尚不清楚 TAB 是否对人体有害，但产生有异味的愈创木酚，会降解果汁和其他产品的质量。即使没有异味，在分配过程中轻微恶化引起的降解也会降低产品的质量。 避免 TAB 污染是非常困难的，特别是在土壤中。幸运的是，引起污染的A. acidocaldarius 和其他主要物种被认为是无害的，TAB 引起的损害能够通过监测被认为有害的A. acidoterrestri 来缩小。因为这些物种生长相对高温和酸性的条件下，不能通过常规的提取培养的方式进行检测。 由于欧洲和其他区域经常发生果汁质变事件，2003年3月日本果汁联合会研发和出版了同一检测 TAB 方法 [4]。为了容易进行该项检测，我们研发了该试剂盒。该试剂盒不同于会产生异味的愈创木酚的A. acidoterrestri 试剂盒。 Guaiacol Detection Kit Reference
	Va-YSG Medium
	Guaiacol Detection Kit

◆试剂盒组成

YSG 琼脂板 20 块板（货号 KYO-06810）

TAB 纯化的 YSG 琼脂培养基

10×2 板/1 盒

 

Va-YSG 培养基 (2 mL) 100 个管子（货号 KYO-08901）

加入到 YSG 培养基的 Vanillic acid ，用于愈创木酚的形成

2 mL×100 管

 

愈创木酚检测试剂盒 100 次（货号 KYO-08921）

试剂１：50 mM 苯二甲酸氢钾缓冲液	60 mL×2 瓶
试剂２：1.3 % 过氧化氢溶液	2.5 mL×1 管
试剂３：过氧化物酶-磷酸缓冲液	2.5 mL×1 管
阳性对照：Guaiacol  (1050 ppm)	2.5 mL×1 管

 

◆TAB 测试流程图-日本果汁协会

  

◆实验流程

1. 用接种环，10 μL，在 YSG 琼脂板上提取的新克隆，该克隆还没有形成孢子。在“Va-YSG medium（2 mL）， ”（≥1×10⁸ cfu/mL）管内重悬该克隆。.

2. 孵育 45±1°C，３小时。

3. 加入１mL“Guaiacol Detection Kit”的试剂１。

4. 加入 20 μL“Guaiacol Detection Kit”的试剂 ２ 。

5. 加入 20 μL 试剂３ of “Guaiacol Detection Kit”试剂３.

6. 混匀。

7. 放置５-10 分钟。

8. 检测培养基颜色的变化。*请在 10 分钟内观察颜色变化。

Brown color indicates contamination of AAT

空白（阴性对照） 

使用没有接种的"Va-YSG medium（２mL）" ，进行步骤（２）-（８）。

阳性对照

2 mL 灭菌水和 100 µL 阳性对照混合，进行步骤（３）-（８）。

处理信息

• 请使用高压灭菌方式处理已经使用的培养基（121℃，超过 30 分钟)

• 保存条件：２-10 ℃，避光。

• 保质期：制造后 12 个月

一般我们提供的产品保质期在３个月到 10 个月。

欲了解详情资料请点击：果汁中嗜热嗜酸菌的检测方法——膜过滤法和涂布法

Guaiacol Detection Kit Flyer
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Q1：  我对 TAB 列举法有些问题。

          a. YSG 灭菌水是什么意思，我想知道制备的比率。

          b. 阳性/阴性测试：样品制备步骤提到的用 YSG 培养基稀释，稀释比例是多少？
          c. 如果是水样品的话，是不是用相同方法？

A1： （ａ,ｂ）回答: 
           "YSG distilled water"是错误说法，正确的说法是“灭菌水”。制备比例的话，请参考下面的信息，不过具体案例具体分析。

           （参考数据来自日本果汁联合会Ｒ）

           ——————————————————–
           果汁　　　　　　〔Brix 值〕　 　参考比例　　
           ———————————————————
           苹果　　　　   　〔70〕　････････  10 倍
           橙子　　　　　　〔65〕　････････  10 倍
           红葡萄　　　　　〔65〕　････････  20-50 倍
           白葡萄　　　      〔65〕　････････   20 倍
           胡萝卜 　　　  　〔40〕　････････  10 倍
           柠檬　　　　   　〔50〕　････････  10 倍　　　
           葡萄柚　　 　     〔55〕　････････   20 倍
           桃子　　　　　   〔55〕　･････････10 倍
           ———————————————————
            ｃ. 水样品的话，是不是用相同方法？
            回答（ｃ）：对不起，我们不能明确告知是否可以运用，我们手头没有相关记录。
           有一种软饮料“near water"，来自调味品，不是果汁（或者少量）和水。我们听说该款产品可用于检测该类饮料。 

Q2：   果糖能够作为样品吗？

A2：   非常抱歉，我们这边没有关于愈创木酚检测糖果（果糖）样品的相关知识。所以我们建议参考简单流程，该流程修改自 

         “Japanese spore counting method of sugar samples”。如果你们有预处理微生物测试的流程，请按照你们的操作流程操作代替操作

           流程中的“样品制备“。该流程中有制备 YSG 液体培养基的方法。如果 您使用我们提供的流程，不需要使用接种环和 YSG 琼脂板。

Q3：   我们使用该试剂盒鉴定 Alicyclobacillus acidoterrestris。我们的客户是做墨西哥沙拉的，它们也有类似愈创木酚的异味。我们是否可

           以用该试剂盒去检测沙拉中的愈创木酚（主要西红柿，红色）？红色是否会干扰？

A3：   我们这边没有数据是关于愈创木酚检测试剂盒检测沙拉酱的案例。如果您考虑观察方法，请参考下面的"注意事项" 。

           注意事项（1）：来自样品的固体如果样品的固体中有 AAT，必须采取胃部处理或者匀浆去除固体的致病菌。

           注意事项（2）：材料中多酚的影响多酚是 AAT（Alicyclobacillus acidoterrestris）生长抑制剂。因此，检测 AAT 必须稀释样品 20~50

                                     倍。否则，无法检测出来。我们不清楚沙拉中有多少多酚。但是西红柿是含有多酚的。一般稀释 10 倍。可以考虑沙拉稀

                                     释超过 20 倍。

           注意事项（3）：关于样品的粘度。稀释降低粘度。因子样品必须适当稀释。请参考微生物稀释比例检测样品，不包括抗热嗜酸性细菌。

           注意事项（4）：关于样品到标本上携带的颜色如果最终采用过氧化物酶方法，如果样品带有棕色的话，可能判断起来很麻烦。如果样品

                                     稀释的话，我认为不会引起大问题。

           注意事项（5）：其他干扰材料如果使用过氧化物酶方法，通过过氧化物酶反应会使愈创木酚（AAT 产物，会引起异味）聚合并且变成棕

                                     色。我们认为沙拉酱包括不同的香味料可以作为材料。因此，如果有材料抑制过氧化物酶反应或者含有的物质可以起过氧

                                     化酶作用，通过过氧化物酶反应变成棕色，会引起假阳性或者假阴性的结果。

Q4：  如何接种 TAB 到 YSG 琼脂板上面？请提供流程。

A4：    根据 Japan Fruit Juice Association，有３种方法

            １）倾注平皿的方法

            ２）用曲面玻璃棒涂布平板的方法 
            ３）MF 方法
            如果告知客户的样品和检测方法，我们可以推荐方法。

            对于您的信息，请让我们知道在我们手册里面 TAB 检测的流程。

Q5：    是否提供不含香草酸的 YSG 培养基？

A5：    是的，我们提供不含香草酸的 YSG 培养基。然而售价会高，也需要额外时间考虑生产。另外，小批量生产会比较难。

Q6：    是否有数据或者参考文献显示 Guaiacol detection kit 的准确性? 我们的客户希望提供上述信息。

A6：    关于产品的准确性，Japan Institute of fruit juice 认可检测操作手册还有手册上提到的批次准确性的数据。

            然后，英文版的操作搜出不提供准确性的信息。

            关于您的要求，请参考下面有研发者 by developer（Motohiro Niwa）写的论文 "Development of a rapid detection method of 

            A. acidoterrestiris, Hazardous bacteria to acidic beverage"。

Q7：   我们需要下面两者之一的微生物菌株 A.acidobacillus 或者 A.acidoterrestris 去完成分析，制定质量政策。是否可以从你们那边获得？

A7：   非常抱歉我们不能提供细菌菌株。您可以通过 ATCC 和 DSMZ 的当地经销商联系购买。

           http://www.atcc.org/About/tabid/138/Default.aspx
           http://www.dsmz.de/
           下面的菌株是分泌愈创木酚的。
           ———————————————————-
          ・　A.acidoterrestris　ATCC49025
          ・　A.acidoterrestris　DSM2498
          ・　A.acidoterrestris　DSM3923
          ・　A.acidoterrestris　DSM3924

Q8：    该试剂盒是否可用于牛奶或者啤酒？

A8：     关于牛奶和啤酒，我们没有相关的信息。

Q9：    该试剂盒可以检测多少愈创木酚？

A9：     Va-YSG 培养基 和 Guaiacol detection kit 能够检测 25 ppm 愈创木酚。

Q10：  是否与关于假阳性结果的信息？

A10：   如果样品中有过氧化物酶或则过氧化氢酶的话，我们试剂盒可能还有假阳性的结果。

Q11：  是否可用 BAT 培养基代替YSG琼脂？

A11：   他们的 YSG 琼脂用这个试剂盒是可以的。我们推荐使用 Va-YSG（KYO- 08901）用于下一步实验室（在 YSG 琼脂上孵育后）。我们的

             试剂盒是基于 Japan Fruit Juice Association 的操作流程， 不推荐使用 BAT 培养基。所以不能保证使用 BAT 培养基的结果。

Q12：  是否可用来检测糖果？

A12：   对不起我们这边没有这方面信息。可以参考“Japanese spore counting method of sugar samples”。

             如果您与细菌检测的预处理流程，请使用您的实验流程代替样品处理。该流程中，有 YSG 液体培养基的制备方法。如果您使用我们建议

            的流程，需要接种环和 YSG 琼脂板。如果不适合您的样品，建议修改。

Q13:    该试剂盒是否可以检测 Ethylvanillin 到 Ethoxyphenol 转变？Ethoxyphenol 也会类似愈创木酚，会有异味？

A13：  该试剂盒有比色法的结果，通过过氧化物酶反应愈创木酚转变成四-愈创木酚检测愈创木酚。关于2-Ethoxyphenol, 也会发生过氧化物酶反

            应，会有比色法结果。然而我们之前没有测试过，也没有看到相关的文献，不能确定。在很多化学物质数据库中我们也没有找到关于异味是

            由 Ethoxyphenol 引起的信息。

Q14：  该试剂盒可检测蜂蜜吗？

A14:     对不起，我们没有做过类似实验。

Guaiakol detection kit reference

【1】	G.Deinhard, et al., Bacillus acidoterrestris sp. nov., a new thermotolerant acidophile isolated from different soils. Syst. Appl. Microbiol. 10, 47-53 (1987)
【2】	GOTO, M., Spore-forming thermo-acidophilic bacilli of the genus Alicyclobacillus, Bokin Bobai, 28 (8), 499-508 (2000), in Japanese
【3】	GOTO, K., Lecture on "Classification and identification of microbes" 1. Classification and properties of new thermo-acidophilic bacilli, January 2001 issue of Soft Drink Technical Data, 9-26 (2001), in Japanese
【4】	Niwa, M., et al., Development of a rapid detection method of A.acidoterrestris, hazardous bacteria to acidic beverage. Fruit processing, 13, 102-107 (2003)
【5】	Japan Fruit Juice Association, On the unified test method for thermo-acidophilic bacilli, Report of Japan Fruit Juice Association, 535, 4-12 (2003), in Japanese
【6】	Niwa, M., et al., A.acidoterretris rapid detection kit, Fruit processing, 13, 328-331 (2003)
【7】	Niwa, M., Control of deleterious bacteria in acidic beverages by using a guaiacol detection kit (peroxidase method), Japan Food Science, 2004-2, 23-28 (2004), in Japanese
【8】	Japan Laid-Open P2003-259A “Detection of guaiacol forming bacteria and/or its identification method”