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- 参考文献
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)
◆产品概要
本试剂盒是可以定性分析细胞培养上清和体液样品中提取的细胞外囊泡，以及定量分析细胞培养上清样品中的细胞外囊泡的ELISA试剂盒。让细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合的蛋白在固定化的板上与细胞外囊泡反应并固定后，用任意细胞外囊泡表面标记蛋白的小鼠单抗作为检测一抗，试剂盒中的HRP标记抗小鼠IgG抗体为二抗，可高灵敏度检测表面具有任意标记蛋白的细胞外囊泡。
◆特点
采用PS结合分子Tim4包被板
● 通过磷脂酰丝氨酸（PS）结合分子进行捕获。※1
● 可检测出0.1 μL左右培养上清液的细胞外囊泡。
● 可用纯化细胞外囊泡标准品※2 定量检测。
● 高灵敏度检测（检测灵敏度可达WB※3 的50～1,000倍）。
高灵敏度定性·定量检测培养上清中的细胞外囊泡
※1 本方法比起使用抗体包被板的ELISA法，可以更好地定性·定量分析细胞外囊泡。
※2 请使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS纯化的细胞外囊泡标准品。
※3 WB法：免疫印迹实验
使用优化的试剂组成的试剂盒
● 优化对照用的一抗※4
● 优化检测用的二抗※5
● 采用显色法
操作简便，实验重复性高
※4 配套抗人CD63抗体。检测其他表面标记蛋白可使用任意小鼠单抗。
※5 配套抗小鼠IgG抗体-HRP标记。
◆试剂盒组成
|
试剂盒组成（96次） |
包装 |
|
捕获外泌体96孔板 |
1个（8 well×12 strips） |
|
反应/洗涤缓冲液（10×） |
50 mL×2瓶 |
|
外泌体结合增强子（100×） |
10 mL×1瓶 |
|
对照一抗Anti-CD63（100×） |
120 μL×1瓶 |
|
二抗HRP缀合抗小鼠IgG（100×） |
120 μL×1瓶 |
|
TMB溶液 |
12 mL×1瓶 |
|
终止液 |
12 mL×1瓶 |
|
封板膜 |
4个 |
|
说明书 |
1本 |
◆应用实例
从各种细胞培养上清提取细胞外囊泡的定性分析
将1 ng从各种细胞培养上清中提取的细胞外囊泡添加至孔中，使用能识别表面标记蛋白CD9、CD63、CD81的一抗通过本试剂盒对各表面标记量进行定性比较。
另外，作为比较参考数据，将150 ng从各细胞培养上清提取的细胞外囊泡进行电泳，使用能识别表面标记的CD9、CD63、CD81的一抗对各表面标记蛋白量以Western blotting进行定性分析。
提取外泌体（1 ng/well）的定性比较数据 参考比较数据
在ELISA系统和WB分析之间，标记蛋白的表达模式具有相关性。
参考数据：各种细胞的外泌体标记蛋白表达分析
分别使用1 ng各种细胞的培养上清液来源纯化外泌体（使用MagCapture来源外泌体提取试剂盒 PS），外泌体标记蛋白CD9、CD63、CD81对应的抗体，进行表达分析。
检测抗体
<ELISA>
抗CD9小鼠单抗（M-L13）
抗CD63小鼠单抗（H5C6）
<WB>
抗CD9兔多抗
抗CD63小鼠单抗（8A12）
抗CD81小鼠单抗（1D6）
细胞株不同，表达量完全不同！
有的细胞株中可能存在对特定标记蛋白的表达较少的外泌体。
从正常人血清中提取的细胞外囊泡的定性分析
从正常人血清的6个样品分别提取细胞外囊泡，通过BCA法算出细胞外囊泡膜上的蛋白浓度。分别添加40、20、10 ng的细胞外囊泡到孔中，用可识别表面标记CD63的对照组检测一抗（试剂盒配套）对检测的OD值进行定性比较。
提取外泌体（1 ng/well）的定性比较数据
即使是从体液样品中纯化的细胞外囊泡也具有良好的线性
从细胞培养上清中提取的细胞外囊泡的检测灵敏度的参考数据
从COLO201细胞培养上清中提取细胞外囊泡，比较本试剂盒和免疫印迹的检测灵敏度。
Western blot和ELISA的检测灵敏度比较
图（a），（b）为使用各种抗CD63抗体（其他公司产品，FUJIFILM Wako产品： 012-27063）进行免疫印迹的检测灵敏度数据
样品：COLO201细胞培养上清提取细胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取）
★：各抗体中免疫印迹的检测上限。
图（c）Exosome ELISA Kit检测上限数据
使用本试剂盒梯度稀释COLO201细胞来源的纯化细胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）后的样品以及仅有缓冲液的空白值检测并制备COLO201标准曲线。利用此标准曲线可算出COLO201来源纯化样品的最低检测灵敏度。（按照各浓度点n=6，空白点n=12检测）
相比免疫印迹，可以更高灵敏度地检测标记蛋白。
从细胞培养上清中提取细胞外囊泡的稀释线性（Linearity）参考数据
用从COLOC201细胞培养上清中提取的细胞外囊泡作为标准品制作标准曲线，评价COLO201细胞培养上清样品的5个稀释度（1：100-1：1600）的线性。
COLO201细胞培养上清
|
COLO201细胞培养上清 |
|||||
|
细胞伤情量 （μL） |
稀释 |
测定值 （ng/mL） |
期望值 （ng/mL） |
预期百分比 |
|
|
比例 |
稀释因子（×） |
||||
|
0.0625 |
1：1600 |
0.000625 |
0.89 |
0.91 |
98.4 |
|
0.125 |
1：800 |
0.00125 |
1.82 |
1.72 |
105.6 |
|
0.25 |
1：400 |
0.0025 |
3.44 |
3.52 |
97.8 |
|
0.5 |
1：200 |
0.005 |
7.04 |
6.78 |
103.9 |
|
1 |
1：100 |
0.01 |
13.6 |
— |
— |
标准品：COLO201细胞来源外泌体
（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS纯化）
检测样品：COLO201细胞培养上清
一抗：试剂盒配套抗CD63抗体
可以确认到良好的稀释线性以及可检测出0.1 μL细胞外囊泡。
检测不同接种细胞数和不同培养时间的培养基中的细胞外囊泡
在T75细胞培养瓶中接种1×107、2×107、3×107的COLO201细胞，培养72 h。每24 h回收一部分的培养上清样品，用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）和试剂盒配套的Control Primary Antibody Anti CD63 (100×) 进行CD63的吸光度检测。
准备4 μL的细胞培养上清，用添加了Exosome Binding Enhancer的反应液/清洗液（1×）稀释至100 μL。
● 检测样品：COLO201细胞培养上清（25倍稀释）
● 接种细胞数：1×107、2×107、3×107个细胞/瓶
● 培养时间：24 h、48 h、72 h
● 一抗：抗CD63抗体
只需使用4 μL的细胞培养上清液，就可直接检测细胞外囊泡量，在讨论新型的细胞株的培养条件时，省去了讨论条件的时间。
可以简单方便地讨论如何分泌最多的细胞外囊泡的条件。
添加药物后引起细胞外囊泡数量的变化
在T225培养瓶接种K562细胞，以无血清培养基培养72 h。之后更换添加终浓度为10 μmol/L的莫能菌素钠和不含莫能菌素钠的无血清培养基，再培养24 h。培养后回收培养上清样品，用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）和试剂盒配套Control Primary Antibody Anti CD63（100×），检测CD63的吸光度。
用添加了Exosome Binding Enhancer的反应液/清洗液（1×）稀释回收后的细胞培养上清，分别作为10倍稀释和100倍稀释的细胞培养上清样品。
● 检测样品：K562细胞培养上清（更换含莫能菌素钠（产品编号：ALX-380-026-G001）的培养基和对照培养基后培养24 h）
● 一抗：抗CD63抗体
无需提取，少量培养基即可检测。
可检测培养基中外泌体量随时间的变化，由于可数值化外泌体变化量，因此相比WB法更容易进行比较。
使用COLO201细胞培养上清来源和人血清来源纯化外泌体比较检测灵敏度
制备下列①~⑥的样品，比较用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒、A公司ELISA试剂盒、A公司ELISA试剂盒（高灵敏型）检测外泌体标记蛋白CD63时的灵敏度。
使用样品内容
① A公司ELISA试剂盒配套标准品
② A公司ELISA试剂盒（高灵敏型）配套标准品
③ 用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS提取COLO201细胞培养上清来源外泌体
④ 用聚合物沉淀法提取COLO201细胞培养上清来源外泌体
⑤ MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS提取人血清来源外泌体
⑥ 聚合物沉淀法提取人血清来源外泌体
|
① |
② |
③ |
④ |
⑤ |
⑥ |
|
|
x1 |
1/16 |
1/1000 |
40 ng/mL |
160 ng/mL |
800 ng/mL |
2000 µg/mL |
|
x0.5 |
1/32 |
1/2000 |
20 ng/mL |
80 ng/mL |
400 ng/mL |
1000 µg/mL |
|
x0.25 |
1/64 |
1/4000 |
10 ng/mL |
40 ng/mL |
200 ng/mL |
500 µg/mL |
|
x0.125 |
1/128 |
1/8000 |
5 ng/mL |
20 ng/mL |
100 ng/mL |
250 µg/mL |
|
x0.0625 |
1/256 |
1/16000 |
2.5 ng/mL |
10 ng/mL |
50 ng/mL |
125 µg/mL |
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒相比A公司ELISA试剂盒和A公司ELISA试剂盒（高灵敏型），可更灵敏地检测到CD63。另外，A公司ELISA试剂盒和A公司ELISA试剂盒（高灵敏型）对各自试剂盒配套标准品的反应敏感，但对PS提取外泌体的反应性弱。
由此证明，PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒相比公司ELISA试剂盒和A公司ELISA试剂盒（高灵敏型），可以更高特异性且高灵敏性地检测外泌体表面的CD63。
◆产品列表
|
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
|
297-79201 |
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD） |
96 tests |
◆相关产品
|
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
|
299-77603 |
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS |
2 tests |
|
293-77601 |
10 tests |
PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）
PS Capture™ Exosome ELISA Kit(Anti Mouse IgG POD)
常见问题
◆试剂盒规格、功能
Q1-1：一定要制备标准品吗？制备标准品时，是否必须使用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS？
A1-1：定量检测时，需要制备作为标准品的细胞外囊泡。超速离心法和聚合物沉淀法等提取的细胞外囊泡也可作为标准品，但还是推荐使用与
A1-1：检测原理相同的PS亲和法提取的细胞外囊泡作为标准品。（详细制备方法请参考MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS的使用说明书）。
Q1-2：为什么没有配套的标准品？
A1-2：每种细胞分泌的细胞外囊泡的表面标记蛋白的种类和含量存在差异，标准品和检测样品的来源细胞必须一致。因此本试剂盒未配套标准品，
A1-1：请制备与样品相同来源细胞的细胞培养上清中提取的标准品。
Q1-3：血清、血浆样品可直接检测吗？
A1-3：PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（Streptavidin HRP）可以直接检测。但是PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）配
A1-1：套的检测二抗与人、小鼠、大鼠IgG发生非特异反应，不适用于人、小鼠、大鼠的血清和血浆样品的直接检测。
Q1-4：细胞培养上清样品可直接测定吗？
A1-4：无论哪个试剂盒都可以直接检测。由于PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）配套的一抗（抗CD63抗体）和二抗都不与
A1-1：牛IgG发生非特异性反应，可直接检测无血清培养基和含FBS培养基的细胞培养上清。另外，PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素
A1-1：HRP）配套的生物素标记抗体（抗CD63-生物素），链霉亲和素HRP也相同。
A1-1：请用于细胞培养上清样品中的细胞外囊泡的定量分析和定性分析。
Q1-5：可以变更一抗吗？
A1-5：可以。使用PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）时，先选择想检测的表面标记小鼠抗体，请根据使用说明书确定最佳浓
A1-1：度。使用PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）时，先选择任意的表面标记检测用生物素标记抗体，请根据使用说明书确定
A1-1：最佳浓度。无法获取生物素标记抗体时，可以使用Biotin Labeling Kit-SH（产品编号：348-90941）或Biotin Labeling Kit-NH2（产品编
A1-1：号：347-90891）非标记抗体进行生物素标记。
Q1-6：残留的试剂应该如何保存？
A 1-6：请参考使用说明书的【6.试剂盒拆分使用时，各组成试剂的保存方法】。
Q1-7：哪些细胞是有纯化实例以及检测实例的细胞。
A1-7：下表为Wako已测试过的细胞系
|
细胞株 |
来源 |
Isolation |
ELISA |
|
A549 |
人肺泡基底上皮腺癌 |
ー |
〇 |
|
BxPC-3 |
人胰腺癌 |
ー |
〇 |
|
COLO201 |
人结肠癌 |
〇 |
〇 |
|
COS7 |
非洲绿猴肾 |
〇 |
〇 |
|
FM3A |
小鼠乳腺癌 |
〇 |
〇 |
|
HCT116 |
人结肠癌 |
〇 |
〇 |
|
HEK293 |
人胚胎肾 |
〇 |
〇 |
|
HEK293T |
人胚胎肾 |
〇 |
〇 |
|
HeLa |
人宫颈癌 |
〇 |
〇 |
|
HPAF Ⅱ |
人胰腺肿瘤 |
ー |
〇 |
|
HuH-7 |
人肝癌 |
〇 |
〇 |
|
HUVEC |
人脐静脉内皮细胞 |
〇 |
〇 |
|
iPS |
诱导多能干细胞 |
〇 |
〇 |
|
K562 |
人慢性粒细胞白血病 |
〇 |
〇 |
|
LNCaP |
人前列腺癌 |
〇 |
〇 |
|
P388D1 |
小鼠白血病 |
〇 |
〇 |
|
Panc-1 |
人胰腺癌 |
ー |
〇 |
|
RAJI |
人伯基特淋巴瘤·B淋巴细胞样 |
〇 |
〇 |
|
SH-SY5Y |
人神经母细胞瘤 |
ー |
〇 |
|
TIG-3 |
正常的二倍体成纤维细胞 |
〇 |
〇 |
|
THP-1 |
急性单核细胞白血病 |
〇 |
〇 |
|
U2OS |
人骨肉瘤 |
〇 |
〇 |
|
BM-MSC |
骨髄来源间充质干细胞 |
〇 |
〇 |
|
iCell-MSC |
iPS 来源间充质干细胞-01279 |
〇 |
〇 |
ー：未测试 〇：有纯化和检测数据
Q1-8：本试剂盒可以检测细胞外囊泡的回收率吗？
A1-8：可以，请参考P25的与聚合物沉淀法比较回收率。
◆与传统方法比较
Q2-1：检测灵敏度高吗？
A 2-1：已证实该试剂盒检测细胞外囊泡，相比使用固相化抗体的ELISA方法或将纯化样品直接固定在平板上的灵敏度要更高。此外，已经实验验证
A 2-1：本试剂盒与Western blotting有相关性。
◆试剂盒的操作方法、组成
Q3-1：本试剂盒的操作时间需要多久？
A 3-1：PS Capture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（ 抗小鼠 IgG POD）的操作流程需要约5 h。具体包括：
A 3-1：①将细胞外囊泡样品固定在孔板上需要2 h；
A 3-1：②一抗的反应需要1 h；
A 3-1：③二抗反应需要1 h；
A 3-1：④TMB反应需要30 min。
A 3-1：再加上其他清洗操作，大约需要5 h才能完成检测。
A 3-1：PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（ 链霉亲和素HRP）的操作流程需要约6 h。具体包括：
A 3-1：①将细胞外囊泡样品固定在孔板上需要2 h；
A 3-1：②一抗的反应需要1 h；
A 3-1：③链霉亲和素 HRP反应需要2 h；
A 3-1：④TMB反应需要30 min。
A 3-1：再加上其他清洗操作，大约需要6 h才能完成检测。
A 3-1：添加终止液后，检测450 nm和副波长620 nm（600~650 nm）的吸光度。
Q3-2：Exosome Capture 96 Well Plate是可循环使用的吗？
A 3-2：终止液会使孔板上的蛋白变性，因此不可循环利用。
Q3-3：实验操作中有可以留到第二天的步骤吗？
A 3-3：将各样品固定在孔板上并保存于4℃，过夜反应也是没有问题的。
◆样品用量
Q4-1：检测使用的样品的最低量是多少？
A 4-1：有相当于1 ng左右细胞外囊泡的蛋白即可检测。从COLO201细胞培养上清中提取的细胞外囊泡检测界限为11 pg。（细胞系不同检测界
A 3-1：限也随之变化。）
Q4-2：直接检测培养上清和体液样品时，需要多少样品？
A 4-2：几微升（1~5 μL）左右的细胞培养上清和体液样品即可充分检测。建议用于检测培养基中的细胞外囊泡量随时间变化，以及分析新型培
A 3-1：养上清样品。但由于细胞类型（iPS细胞等）不同，可能出现培养基中的细胞外囊泡量少的情况。不清楚样品中的细胞外囊泡量时，推荐
A 3-1：进行预实验确定合适的上样量。
◆相关产品
Q5-1：有推荐使用的一抗吗？
A5-1：以下抗体是FUJIFILM Wako已验证可在该ELISA法中使用的抗体。
|
抗原 |
反应 |
抗体 |
生产商 |
应用 |
|
CD9 |
人、牛 |
抗CD9小鼠单克隆抗体(1K) |
Wako, 产品编号： |
WB、ELISA、FCM、IP |
|
CD63 |
人 |
抗CD63小鼠单克隆抗体(3-13) |
Wako,产品编号： |
WB、ELISA、FCM、IP |
|
CD81 |
人 |
抗CD81小鼠单克隆抗体(17B1) |
Wako, 产品编号： |
WB、ELISA、FCM、IP |
|
CD9 |
小鼠 |
抗CD9大鼠单克隆抗体(MZ3) |
Bio Legend, 产品编号：124802 |
ELISA |
|
CD63 |
小鼠 |
抗CD63大鼠单克隆抗体(NVG-2) |
Bio Legend, 产品编号：143902 |
ELISA |
|
CD81 |
小鼠 |
抗CD81亚美尼亚仓鼠单克隆抗体(Eat-2) |
Bio Legend, 产品编号：104902 |
ELISA |
◆疑难
Q6-1：无法顺利检测结果，应该如何处理？
A6-1：请确认使用的各个试剂是否都还在有效期内。请务必添加Exosome Binding Enhancer（100×）至Washing Buffer。若是无法确认试剂盒
A 3-1：配套的Control Primary Antibody Anti CD63（100×）和Control Biotinylated Antibody Anti-CD63（100×）的信号的情况下，请考虑
A 3-1：CD63的表达量是否在检测界限之下或其他原因，或咨询FUJIFILM Wako在当地的代理商。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 |