–Cellstain^®– Hoechst 33258 solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– Hoechst 33258 solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

核染色用色素

• 製品コード
  H341　 –Cellstain^®– Hoechst 33258 solution
• CAS番号
  23491-45-4(Hoechst 33258)
• 化学名
  2′-(4-Hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride, solution
• 分子式・分子量
  C₂₅H₂₇Cl₃N₆O=533.88

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マニュアル

Q

Hoechst 33258 ,Hoechst 33342 solutionの励起波長、蛍光波長とこれらの違いについて教えて下さい。

A

波長は以下の通りです。
Hoechst33342 Ex:350 nm Em:461 nm
Hoechst33258 Ex:352 nm Em:461 nm

基本的な使用方法は両方とも同じです。
弊社の製品は水溶液になっておりますので、
ご希望の濃度の希釈し、添加して下さい。

この二つの違いですが、基本的にはAdenine-Thymidine部に特異的に結合する薬品です。
生細胞の膜も通過し、生細胞のDNAとも結合します。
膜の透過率はHoechst 33342の方が若干高いです。
Hoechst33258はdsDNA selectivのようです。

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。
【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

Hoechst33258の使用方法を教えてください。

A

 色々な使い方がありますが、一例として形態観察の例を示します。
アポトーシス細胞の核変化(クロマチン凝縮、断片化)を手軽に観察する方法として用いられます。

＜試薬＞

・細胞固定液：1％グルタルアルデヒド/PBS(-)

・蛍光染色液：1 mM Hoechst33258/PBS(-)
　　　*同仁の製品は[1 mg/mL]になっています(約1.87 mmol/L)

＜操作方法＞

1．約1X10⁶個の細胞を含む細胞培養液を400 Xg，5 min遠心し、上清を捨てる。

2. 細胞固定液を100 μL加え、ピペッティング等により混和する。

3. 室温で30 min静置する。

4. 400Xg,5 min遠心し、上清を捨てる。

　　PBS(-)を1 mL加え、ピペッティング等により混和した後、400Xg､5 min遠心し上清を捨てる。

　　（＊このときグルタルアルデヒドをよく洗浄除去する。退色の原因になります）

5. PBS(-)を20 μL加え、混和した後、蛍光染色液を4 μL加え混合する。

6. スライドガラス上に(5)の細胞液を1滴落し、カバーガラスをのせ、端を押さえる。

7. 蛍光顕微鏡下で観察する。

＊細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ「アポトーシス実験プロトコール」田沼靖一監修より