Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

08 ラベル化剤

Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

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抗体・タンパク質標識キット

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  LK13　 Alkaline Phosphatase Labeling Kit – SH

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マニュアル

Q

Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。

A

はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。
下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル　～カスタマーサポートの視点から～」

Q

サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

A

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1万以上＞
影響する可能性があります。
高分子でSH基をもつ化合物は、Filtration Tubeでも除くことができません。 そのため標識され、蛍光性不純物として影響します。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。 一方、SH基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。
＊本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗体の精製について、小社抗体精製キット（下記）を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A　　　IgG Purification Kit – G

 

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code：AP01もしくはAP02)

市販の抗体 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書に従って、精製を行う。

 

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ（Collagenase）によるゼラチン分解

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: ゼラチン含有IgG溶液 2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬 ・コラーゲナーゼ（Sigma, #C7826） 3.5 CDU/ml 希釈溶液 ・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ・市販の抗体 200 μg (2)精製方法 ・0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。 ・37℃、3時間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※IgG Purification Kitでは、抗体を固定化担体に保持させる際の抗体溶液量を一回当たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗体溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを担体に保持させる操作を8回（200 μl×7, 100 μl×1）に分けて行う。 ※上記の方法で得られる抗体の回収率：45～50%

B. 300K 限外ろ過チューブを用いたゼラチン除去

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE 1: IgG 2: ゼラチン含有IgG溶液 3: 300K限外濾過のみのIgG溶液 4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬 ・300K フィルトレーションチューブ（Pall社 ナノセップ遠心ろ過デバイス（製品コード：OD300C33） ・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02） ・市販の抗体 200 μg (2)精製方法 ・0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過を行う（200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g）。 ・その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。 ※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。 ゲルへの吸着操作は5回繰り返す。 ※上記の方法で得られる抗体の回収率：35～45%

 

Q

SH-Reactive ALPはbufferに溶解後、保存できますか？

A

溶解後は保存せず、すぐに使用して下さい。
SH-Reactive ALPは水溶液にすると反応部位が徐々に分解するため、反応効率が低下します。

Q

サンプルが水溶液になっていますが、ラベル化に問題はないでしょうか？

A

問題はありません。

但し、添付のFilitration tubeの容量に制限がありますので、サンプル溶液の容量は100 μl以下である必要があります。
また、サンプルの濃度が0.5 mg/ml以下（50 μg/100 μl以下）である場合は、Filitration tubeを用いてサンプル量が50～200 μgとなるようにして下さい。
溶液をFilitration tubeにいれて遠心して溶液を除く操作を行って下さい。(必要であれば繰り返す)
フィルター上に残っているサンプルの量が50～200 μgとなればよいので、改めて溶解させる必要はありません。

＊注：低分子の阻害物質は最初の段階で除かれますが、高分子(分子量1万以上)の阻害物質(例；BSA、ゼラチン)は除くことが出来ません。使用前に別途除去して下さい。

Q

低分子のタンパク質（分子量50,000 以下）に標識する場合の方法を教えて下さい。

A

キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。

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PALL社　ナノセップ　 3K　製品No.OD003C33
PALL社　ナノセップ　10K　製品No.OD010C33 
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キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することがございますので遠心時間はご検討下さい。

Q

どのようなものが標識できますか？

A

分子量が「50,000 以上」で[S-S]もしくは[SH]を有しているもの、分子量が「5,000 以下」で[SH]を有している化合物(抗体、蛋白質など)であれば標識できます。

分子量が「5,000以下」、「50,000 以上」で操作方法が若干異なりますので、製品に添付の説明書をご覧いただき標識反応を行ってください。

Q

IgG １分子に対して、どれくらいのAlkaline Phosphataseが標識されますか？

A

還元IgG １分子に対して平均1～2分子のAlkaline Phosphataseが標識されます。

Q

標識率は出せますか？

A

標識後のサンプル溶液には、未反応のReactive体が含まれるため標識率を算出することはできません。

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