上海金畔生物科技有限公司代理日本同仁化学试剂盒全线产品，欢迎访问日本同仁化学dojindo官网了解更多信息。

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
細胞機能解析
細胞老化

老化細胞検出キット

製品コード

SG03　 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
10 assays	￥40,200	347-09181

キット内容

10 assays	[10 assays:　35 mm dish] ・SPiDER-βGal ・Bafilomycin A1	x 1 x 1

試験成績書

SDSダウンロード

ご購入方法
お問い合わせ

マニュアル

取扱説明書日本語
取扱説明書 English
プロトコル老化細胞を検出したい

技術情報

技術情報の目次

原理
蛍光特性（β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGal）
本キットを使用した論文
キットの使用手順
特長①．生細胞も固定化細胞も適用できる
特長②．定量が容易にできる
一般的な老化細胞マーカー
異なる老化マーカーとの共染色
組織サンプル中のSA-β-gal検出
T細胞(浮遊細胞)におけるSA-β-gal検出
細胞老化と細胞周期との関連性
共焦点定量イメージサイトメーターによる定量解析

細胞老化と細胞周期との関連性

細胞周期のG2/M 期に作用して細胞増殖を停止させ、細胞老化を誘導することが知られているDoxorubicin(DOX) をA549 細胞へ添加後、本製品で細胞老化、Cell Cycle Assay Solution Blue （製品コード：C549）/ Deep Red（製品コード：C548）でA549 細胞における細胞周期の変化と、JC-1 MitoMP Detection Kit （製品コード：MT09）でミトコンドリア膜電位の変化を確認しました。

技術や使用製品に関する補足

細胞周期測定試薬

Cell Cycle Assay Solution Blue
ミトコンドリア膜電位検出キット

JC-1 MitoMP Detection Kit

参考文献

参考文献を表示する

文献No.	対象サンプル	装置	引用（リンク）
1)	細胞（HEK）遺伝子（LacZ）	蛍光顕微鏡フローサイトメーター	T. Doura, M. Kamiya, F. Obata, Y. Yamaguchi, T. Y. Hiyama, T. Matsuda, A. Fukamizu, M. Noda, M. Miura, Y. Urano, "Detection of LacZ-Positive Cells in Living Tissue with Single-Cell Resolution.", Angew Chem Int Ed Engl., 2016, 55, 33
2)	組織（マウス脂肪）	蛍光顕微鏡	T. Sugizaki, S. Zhu, G. Guo, A. Matsumoto, J. Zhao, M. Endo, H. Horiguchi, J. Morinaga, Z. Tian, T. Kadomatsu, K. Miyata, H. Itoh & Y. Oike, "Treatment of diabetic mice with the SGLT2 inhibitor TA-1887 antagonizes diabetic cachexia and decreases mortality", Nature Partner Journal：Aging and Mechanisms of Disease., 2017, doi:10.1038/s41514-017-0012-0.
3)	細胞（HSP27-knockdown）タンパク質（Ki67、cyclin B1）	蛍光顕微鏡	A. Park, I. Tsunoda and O. Yoshie, "Heat shock protein 27 promotes cell cycle progression by down-regulating E2F transcription factor 4 and retinoblastoma family protein p130", J. Biol. Chem., 2018, doi: 10.1074/jbc.RA118.003310 .
4)	細胞（A549)	蛍光顕微鏡フローサイトメーター	R. Tanino, Y. Tsubata, N. Harashima, M. Harada and T. Isobe, "Novel drug-resistance mechanisms of pemetrexed-treated non-small cell lung cancer", Oncotarget., 2018, 9, (24), 16807.
5)	細胞（NHDF)	蛍光顕微鏡	Y. Kitahiro, A. Koike, A. Sonoki, M. Muto, K. Ozaki and M. Shibano. , "Anti-inflammatory activities of Ophiopogonis Radix on hydrogen peroxide-induced cellular senescence of normal human dermal fibroblasts.", J Nat Med., 2018, 72, 905.
6)	組織（老齢マウス腸上皮オルガノイド）	蛍光顕微鏡	R. Uchida, Y. Saito, K. Nogami, Y. Kajiyama, Y. Suzuki, Y. Kawase, T. Nakaoka, T. Muramatsu, M. Kimura and H. Saito, "Epigenetic silencing of Lgr5 induces senescence of intestinal epithelial organoids during the process of aging", NPJ Aging Mech Dis., 2018, doi：10.1038/s41514-018-0031-5.
7)	組織（腎臓凍結切片）	蛍光顕微鏡	S. R. Kim, A. Eirin, X. Zhang, A. Lerman and L. O. Lerman, "Mitochondrial Protection Partly Mitigates Kidney Cellular Senescence in Swine Atherosclerotic Renal Artery Stenosis.", Cell. Physiol. Biochem., 2019, 52, 617.
8)	細胞（HN6, HN12, HN13）	フローサイトメーター	Liana P. Webber, Veronica Q. Yujra, Pablo A. Vargas, Manoela D. Martins. Cristiane H. Squarize, Rogerio M. Castilho, "Interference with the bromodomain epigenome readers drives p21 expression and tumor senescence", Cancer Letters., 2019, doi.org/10.1016/j.canlet.2019.06.019.
9)	細胞（UE7T-13）	フローサイトメーター	H. Ise, K. Matsunaga, M. Shinohara and Y. Sakai, Improved Isolation of Mesenchymal Stem Cells Based on Interactions between N-Acetylglucosamine-Bearing Polymers and Cell-Surface Vimentin ", Stem Cells Int., 2019, 4341286, 13.
10)	細胞（マウス角膜間質）	フローサイトメーター	X. Wang, M. Qu, J. Li, P. Danielson, L. Yang and Q. Zhou, Induction of Fibroblast Senescence During Mouse Corneal Wound Healing.", Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2019, 60, (10), 3669.
11)	細胞（VZ/SVZ)	フローサイトメーター	Y. Nakatani, H. Kiyonari and T. Kondo, Ecrg4 deficiency extends the replicative capacity of neural stem cells in a Foxg1-dependent manner.", Development., 2019, 146, (4), 18.
12)	細胞（HaCaT, HEK001)	蛍光顕微鏡	Y. S. Ryu, K. A. Kang, M. J. Piao, M. J. Ahn, J. M. Yi, G. Bossis, Y. M. Hyun, C. O. Park and J. W. Hyun, Particulate matter-induced senescence of skin keratinocytes involves oxidative stress-dependent epigenetic modifications", Exp. Mol. Med., 2019, 51, 108.
13)	細胞（HT1080)	蛍光顕微鏡	E. M. Angela Ibler, E. Mohamed, L. N. Kathryn, A. B. Natalia, F. E. K. Sherif and H. Daniel, Typhoid toxin exhausts the RPA response to DNA replication stress driving senescence and Salmonella infection', Nat Commun., 2019, 10, 4040.
14)	– (Review)	フローサイトメーター	B.L. Torres, A. Estepa-Fernandez, M. Rovira, M. Oraez, M. Serrano, R. Martinez-Manez and F. Sancenon,"The chemistry of senescence.", The chemistry of senescence., 2019, (3), 426-411
15)	細胞（HepG2）	蛍光顕微鏡	三谷塁一, "肝臓のミトコンドリア活性化に及ぼす大豆イソフラボンの効果とその分子機構に関する研究", 大豆たん白質研究, 2019, 21
16)	細胞（PC12）	蛍光顕微鏡	N. Wang, H. Wang, L. Li, Y. Li and R. Zhang, "β-Asarone Inhibits Amyloid-β by Promoting Autophagy in a Cell Model of Alzheimer's Disease.", Front Pharmacol., 2020, 10, 1529
17)	細胞（A2780)	フローサイトメーター	Z. Wang, J. Gao, Y. Ohno, H. Liu and C. Xu, "Rosiglitazone ameliorates senescence and promotes apoptosis in ovarian cancer induced by olaparib.", Cancer Chemother Pharmacol., 2020.
18)	組織（マウス腎臓凍結切片）	蛍光顕微鏡フローサイトメーター	J. H. Cho, E. Kim, Y. Son, D. Lee, Y. S. Park, J. H. Choi, K. Cho, K. Kwon and J. Kim, "CD9 Induces Cellular Senescence and Aggravates Atherosclerotic Plaque Formation.", Cell Death Differ., 2020, doi: 10.1038/s41418-020-0537-9
19)	細胞（T cell）	フローサイトメーター	S. Yoshida, H. Nakagami, H. Hayashi, Y. Ikeda, J. Sun, A. Tenma, H. Tomioka, T. Kaawano, M. Shimamura, R. Morishita and H. Rakugi, "The CD153 vaccine is a senotherapeutic option for preventing the accumulation of senescent T cells in mice.", Nat. Commun., 2020, 11, (2482), doi:10.1038/s41467-020-16347-w
20)	細胞（PC12）	蛍光顕微鏡	N. Wang, H. Wang, L. Li, Y. Li and R. Zhang, "β-Asarone Inhibits Amyloid-β by Promoting Autophagy in a Cell Model of Alzheimer's Disease.", Front Pharmacol., 2020, 10, 1529
21)	細胞（ARPE-19）	蛍光顕微鏡	T. Yamazaki, H. Suzuki, S. Yamada, K. Ohshio, M. Sugamata, T. Yamada and Y. Morita, "Lactobacillus paracasei KW3110 Suppresses Inflammatory Stress-Induced Premature Cellular Senescence of Human Retinal Pigment Epithelium Cells and Reduces Ocular Disorders in Healthy Humans”, Int J Mol Sci, 2020, 21(14), 5091
22)	細胞 (ゼブラフィッシュの上皮細胞)	蛍光顕微鏡	Y. Haraoka, Y. Akieda, Y. Nagai, C. Mogi and T. Ishitani, "Zebrafish imaging reveals TP53 mutation switching oncogene-induced senescence from suppressor to driver in primary tumorigenesis", Nat. Commun., 2022, doi:10.1038/s41467-022-29061-6.

よくある質問

Q 1キット当りの使用回数の目安は？: A

目安となる使用回数については、下記の容器毎の数量をご参考ください。

※１ウェル当りに添加する染色溶液の量によって上記の数量は変わります。
　使用する容器と必要な１ウェル当りの染色溶液量を予め確認の上、ご使用ください。

Q Bafilomycin A1 を添加する理由を教えて下さい。: A

多くの細胞には内在性のβ-ガラクトシダーゼの存在が知られていますが、SPiDER-βGalは、内在性のβ-ガラクトシダーゼと老化マーカーであるSA-β-Galともに反応するため、老化が認められていない細胞でも、バックグラウンドが高くなり、SA-β-Galの検出に支障が出てきます。
Bafilomycin A1は、リソソーム中のATPase活性を阻害し、リソソーム中のpHを酸性から中性付近に変化させますが、この作用により内在性β-ガラクトシダーゼの活性が低下します。そのため、SPiDER-βGalを添加する前にBafilomycin A1で細胞を処理することで、SPiDER-βGalはSA-β-Galと反応して老化細胞を蛍光染色することができます。

左図ではBafilomycin A1の添加有無によるSA-β-Gal検出の違いを示しています。

なお、Bafilomycin A1は、オートファジー阻害剤としての利用も知られています。ご利用の際は、実験系に支障があるかご検討の上、支障が有る場合は、固定化細胞の利用をお勧めします。固定化細胞を用いる場合は、バッファーで細胞内pHをコントロールするため、Bafilomycin A1 は使用しません。取扱説明書に記載された手順に従って染色することができます。

Q DMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか？: A

SPiDER-βGal DMSO stock solution及びBafilomycin A1 DMSO stock solution調製後は、-20℃保存した場合に1か月間安定であることを確認しています。

Q Working solutionは、どのくらい安定ですか？: A

SPiDER-βGal working solution及びBafilomycin A1 working solutionは保存できないため、用時調製して下さい。

Q 老化細胞を蛍光観察する際の注意点はありますか？: A

細胞老化が進むと細胞内にリポフスチンと呼ばれる不溶性物質が蓄積してきます。リポフスチンは自家蛍光を発するため蛍光観察時にバックグラウンドとして影響することがあります。その場合、老化細胞中のSA-β-gal活性を正確に評価するために、SPiDER-βGalを添加しない試料もご用意いただき確認することをお勧めします。

○フローサイトメーターの場合
・「老化細胞」および「老化していない細胞」を用いて、各々①②の平均蛍光強度(MFI)を測定してください。
　　　①SPiDER-βGalを添加した細胞
　　　②SPiDER-βGalを添加していない細胞（バックグラウンド）

・「①の平均蛍光強度」から「②の平均蛍光強度」を差し引いてください。
　バックグラウンドを差し引いたSA-β-gal由来の蛍光強度をSA-β-gal活性の指標とします。
　　　a：SA-β-gal活性（老化細胞）　　　　　 = ①の平均蛍光強度　－　②の平均蛍光強度
　　　b：SA-β-gal活性（老化していない細胞） = ①の平均蛍光強度　－　②の平均蛍光強度

・上記の aおよびb の値を比較することで、SA-β-gal活性として評価してください。
また、上記のaからbを差し引くことで細胞老化に伴うSA-β-gal活性の変化を確認できます。

○蛍光顕微鏡の場合
・初めにSPiDER-βGalを添加していない老化細胞を用いて蛍光観察してください。
・リポフスチン由来の蛍光像（バックグラウンド）が影響を与えない程度に感度（gainなど）を調整してください。
・その後、同じ撮影条件でSPiDER-βGalを添加した細胞や老化していない細胞の蛍光観察を行い評価してください。

Q 細胞を固定化した後に、SA-β-galは染色できますか？: A

可能です。固定化した場合、Bafilomycin A1を用いた細胞の前処理は必要ありませんが、pH6.0に調整したMcIlvain bufferを別途準備して頂く必要があります。詳細は取扱説明書をご覧ください。

Q 固定化細胞をフローサイトメーターを用いて検出するプロトコルを教えて下さい。: A

下記のプロトコルを参照ください。

(1) 細胞を35 mmディッシュに播種し、37℃、5% CO²インキュベーターで一晩培養する。
(2) 培地を吸引除去し、HBSS 2 mlで1回洗浄する。
(3) トリプシンで細胞を剥がし、培地500 μlで回収する。
(4) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(5) 2% PFA/PBS 100 μlに懸濁し、室温で5分間固定する。
(6) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(7) HBSS 500 μLに懸濁し、300×gで5分間遠心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(8) SPiDER-βGal working solution(固定化細胞用) 500 μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。
　　 ※pHの変動を抑えるため、5% CO₂インキュベーターは使用しない。
(9) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(10) HBSS 500 μlに懸濁し、300×gで5分間遠心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(11) HBSS 500 μlを加えて細胞を回収し、フローサイトメーターにて解析する。

Q 細胞を固定化後にSA-β-gal検出および免疫染色はできますか？

はい、染色は可能ですが、細胞を固定化するとSA-β-galが低下する可能性があります。（下記の^※2に注意事項を記載）
以下の実験例を参照しご検討ください。

WI-38細胞を固定化後に、SA-β-gal検出およびγ-H2AX（DNA損傷マーカー）の免疫染色を行った。

＜実験操作＞

(1)	WI-38細胞を35 mm dishに播種し、37℃、5% CO₂インキュベーターで一晩培養した。
(2)	培養上清を除き、4% Paraformaldehyde/PBS溶液2 mlを細胞に添加し、室温で3分間インキュベートした^※1。
(3)	PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(4)	SPiDER-βGal working solution ^※2 2 mlを添加し、37℃で30分間インキュベートした^※3。
(5)	PBS 2 mlで細胞を2回洗浄した。
(6)	0.1% Triton X-100/PBS 2 mlを細胞へ添加し、室温で30分間インキュベートした。
(7)	PBS 2 mlで2回洗浄した。
(8)	1% BSA/PBS溶液2 mlを細胞へ添加し、室温で1時間インキュベートした。
(9)	抗γ-H2AX IgG (マウス由来)を1% BSA/PBS溶液にて希釈後、細胞に添加し4℃で一晩インキュベートした。
(10)	PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(11)	抗マウスIgG(Cy5標識)を1% BSA/PBSで希釈後、細胞に添加し室温で1時間インキュベートした。
(12)	上清を除き、PBS 2 mlで細胞を2回洗浄し蛍光顕微鏡下で観察した。
※1	固定化時間を長くすると、SA-β-gal活性が低下します。
※2	細胞の固定化操作によりSA-β-gal活性が低下する可能性があります。もしSA-β-gal評価時に十分な蛍光強度が得られない場合は、SPiDER-βGal DMSO stock solution を500-1000倍に希釈しご使用ください。通常はSPiDER-βGal DMSO stock solutionをMcIlvaine buffer（pH 6.0）にて2,000倍の希釈を推奨。希釈倍率の異なるSPiDER-βGal working solutionの結果をFig.1に示す。
※3	インキュベートの際は、5% CO₂インキュベーターでは行わないこと。5% CO₂インキュベーター内に固定化した細胞をおくと、バッファーが酸性になることで内在性のβ-galactosidase活性が上昇することが考えられる。結果として、バックグラウンドが上昇し、老化細胞と若い細胞のSA-β-gal活性の差が見えにくくなる。

＜実験データ＞

図1 免染前後におけるSPiDER-βGal染色の蛍光強度変化

免疫染色の前後でSPiDER-βGalの蛍光強度を比較すると、固定化を行う免疫染色の過程でSPiDER-βGalの蛍光強度が低下していることを確認した。

図2 希釈倍率の異なるSPiDER-βGalによる染色例（免疫染色後）
　赤： SPiDER-βGal、青： γ-H2AX　＜露光時間: 1.5 sec＞

SPiDER-βGal working solutionの希釈倍率を2000倍から666倍に変更することで、免疫染色（固定化）により低下したSPiDER-βGalの蛍光強度が免疫染色前と同程度の強度を示すことを確認した。

Q 染色後の蛍光が弱くて確認できないのですが、対策を教えてください。: A

下記の3点についてご確認またはご検討ください。

①ご使用のフィルターが試薬の蛍光特性に合致している。
　＜推奨フィルター＞
　　・蛍光顕微鏡：　励起（500-540 nm）, 蛍光（530-570 nm）
　　・フローサイトメーター：　励起（488 nm）, 蛍光（500-540 nm）
　
②各working solutionは用時調製したものを使用する。

③染色時間を長くする。
　SPiDER-βGal working solution添加後、30分間のインキュベーションで蛍光が確認できない場合は、インキュベーション時間を45-60分間を目安にご検討ください。

Q SA-β-Gal発現細胞を染色後、細胞は固定化できますか？: A

可能です。4%パラホルムアルデヒドを用いて固定化することを推奨します。

Q 培地中の血清やフェノールレッドは検出に影響しますか？: A

培地中の血清およびフェノールレッドは、SA-β-galの検出には影響しません。

Q 老化細胞とコントロール細胞で蛍光強度に差がない場合、何を確認したら良いですか？: A

STEP1:顕微鏡の観察条件を最適化してください。
STEP2:観察条件を最適化しても解決しない場合、染色条件の最適化を行ってください。

—————————————————————————
STEP1＜顕微鏡の観察条件を最適化＞

コントロール細胞の蛍光と老化細胞の蛍光に差が見られない場合下記をご確認ください。

・コントロール細胞を観察し蛍光が僅かに確認できる条件までGain、レーザー強度を下げる、または露光時間を短くする。
(共焦点顕微鏡：Gain、レーザー強度の調整　落射型顕微鏡：露光時間の調整)

・老化細胞の蛍光を観察し、コントロール細胞との蛍光の差を確認する。

・蛍光の差がみられない場合はSTEP2を確認する。

※観察する部分がガラスボトムシャーレの容器をお使いください。

顕微鏡観察条件とコントロールおよび老化細胞の蛍光強度の関係

—————————————————————————
STEP2＜染色条件の最適化＞

細胞によっては、SPiDERの染色時間もしくは濃度の検討が必要な場合がございます。
以下を目安に最適条件をご検討ください。
染色時間：10分～60分
染色濃度：取扱説明書に記載の濃度の1/2量～2倍量

※観察する細胞数が少ないと感度が得られない場合がございます。
　必要に応じて、細胞数の最適化を行ってください。

染色条件とコントロールおよび老化細胞の蛍光強度の関係