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钙离子荧光探针Fluo-3FF,五钾盐
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货号 | 21019 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
| 规格 | 1 mg | 价格 | 3840 | |
| Ex (nm) | 507 | Em (nm) | 516 | |
| 分子量 | 981.94 | 溶剂 | Water | |
| 产品详细介绍 | ||||
简要概述
不渗透细胞的Fluo-3FF是Fluo-3的类似物，钙结合亲和力低得多，Kd〜10 µM。像Fluo-3一样，该指示剂基本上是无荧光的，但在结合钙时显示出强烈的荧光增强，并且没有光谱偏移。
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钙离子篇：时间轴式讲解应用于钙离子检测的探针
产品说明书
钙指示剂AM Esters的使用
1.带有钙指示剂AM酯：
AM酯是非极性酯，很容易穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。AM酯被广泛用于无创地将各种极性荧光探针装载到活细胞中。但是，使用AM酯时必须特别注意，因为它们易于水解，特别是在溶液中。它们应该用高质量的无水二甲基亚砜（DMSO）进行重构。DMSO储备溶液应在-20°C的干燥环境中保存，并避光。在这些条件下，AM酯应稳定数月。
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。该协议仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。
a）在高质量无水DMSO中制备2至5 mM AM酯储备溶液。
b）在实验当天，将固体的钙指示剂溶解在DMSO中，或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在您选择的含0.04％Pluronic®F-127的缓冲液（例如Hanks and Hepes缓冲液）中，准备2至20 µM的工作溶液。对于大多数细胞系，我们建议钙指示剂的终浓度为4-5 uM。必须根据经验确定细胞加载所需指示剂的确切浓度。为避免因过载和潜在的染料毒性而导致的任何伪影，建议使用可以产生足够信号强度的最小探针浓度。
c）如果您的细胞（例如CHO细胞）中含有有机阴离子转运蛋白，则可以将丙磺舒（2–5 mM）或亚砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为1）丙磺舒为-2.5 mM，亚磺酰吡嗪为0.1 -0.25 mM，以减少去酯化指示剂的泄漏。
d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）添加到细胞板中。
e）在温度或37°C下将染料加载板室孵育20分钟（尤其是Fluo-8 AM）至2小时，然后在室温下将板孵育30分钟。
注1：降低加载温度可能会减少指示器的分隔。
注2：将Cal-520 AM孵育2小时以上，对于某些细胞系会产生更好的信号强度。
f） 用HHBS或您选择的缓冲液（包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1 mM丙磺舒，如果适用）替换染料工作溶液，以除去过量的探针。
g）在所需的Ex / Em波长下运行实验。
2.测量细胞内钙响应：
为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的Kd，使用以下等式：
[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]
其中F是实验钙水平下指示剂的荧光，Fmin是不存在钙时的荧光，Fmax是钙饱和探针的荧光。
解离常数（Kd）是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比，荧光指示剂的Ca结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显着。 细胞内指标的原位反应校准通常产生显着高于体外测定的Kd值。 通过在离子载体如A-23187,4-溴A-23187和离子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的Ca2+缓冲液来进行原位校准。 或者，细胞透化剂如洋地黄皂苷或X-100可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控Ca2+水平。
参考文献
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