适用仪器

简要概述

1. 用测试化合物进行细胞准备工作
2. 去掉培养基
3. 加入CytoCalcein™Red AM工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）
4. 室温下孵育30min-1h
5. 监测Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的荧光强度（底部读取模式）

储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1. CytoCalcein™Red AM储备溶液：
向CytoCalcein™Red AM小瓶（组分A）中加入20 µL DMSO（组分B），并充分混合以制成CytoCalcein™Red AM储备液。 注意：20 µL CytoCalcein™Red AM储备液足以装满一块板。 避光。 为了存放，请将管子紧紧密封。 注意：如果试管密封严密，可将未使用的CytoCalcein™Red储备液分装并在<-20℃下保存1个月。 避免重复冻融循环。

工作溶液配制
将全部内容物（20 µL）的CytoCalcein™Red AM储备溶液添加到10 mL的测定缓冲液（组分C）中，并充分混合以制成CytoCalcein™Red AM工作溶液。 注意：此CytoCalcein™Red AM工作溶液不稳定，请立即使用。 注意：如果这些细胞（例如CHO细胞）含有会导致荧光染料随时间泄漏的有机阴离子转运蛋白，则应准备丙磺舒储备溶液并以最终孔内工作浓度1加入到缓冲液中 -2.5毫米 分装并保存未使用的丙磺舒储备溶液于≤-20 ℃。

操作步骤

1. 根据需要用测试化合物处理细胞。 注意：添加化合物之前不必洗涤细胞。 但是，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在添加化合物之前将生长培养基和血清因子吸掉。 加入100 µL /孔（96孔板）和25 µL /孔（384孔板）的1X Hank盐溶液和20 mM Hepes缓冲液（HHBS）或抽吸后选择的缓冲液。 或者，细胞可以在无血清培养基中生长。
2. 去除生长培养基
3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的CytoCalcein™Red AM工作溶液。
4. 在避光的条件下，在室温或37°C下孵育板30分钟至1小时。 注意：适当的孵育时间取决于所用的单个细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。 对于非贴壁细胞，建议在孵育后以800 rpm的速度离心细胞板2分钟。
5. 使用荧光酶标仪（底部读取模式）在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下监控荧光强度。

数据分析

从空白标准孔获得的读数（RFU）用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值即可得到基线校正值。 然后，绘制标准读数，以获得标准曲线和方程式。 此方程式可用于计算HeLa细胞样品。 我们建议您使用在线线性回归计算器，该计算器可在以下网址找到：https://www.aatbio.com/tools/linear-logarithmic-semi-log-regression-online-calculator

参考文献

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