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Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒*荧光能量共振转移法*
| 货号 | 36381 | 存储条件 | 避免光照, 在2-8度冷藏保存 |
| 规格 | 50 plates | 价格 | 45432 |
| Ex (nm) | 390 | Em (nm) | 650 |
| 分子量 | 溶剂 | ||
| 产品详细介绍 | |||
简要概述
Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法，用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比，这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记，而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下，trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是，测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物，因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命，而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 推荐孔板： | 黑色孔板或黑色透明底板 |
| 使用 | 时间分辨荧光分析 |
产品说明书
样品实验方案
溶液配制
储备溶液配制
cAMP标准（1mM）：将100 µL稀释剂（组分E）添加到cAMP标准品（组分C）中，并充分混合。 注意：未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。
工作溶液配制
1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液：将55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）添加到Anti cAMP-trFluor Eu（组分A）小瓶中。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。
2. cAMP-trFluor 650工作溶液：在cAMP-trFluor 650小瓶（组分B）中加入55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）。 将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。
实验步骤
1.细胞制备：
1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。
1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中，在96孔板中培养。 实验前，将板以800 rpm的速度离心2分钟。
1.3根据需要处理细胞：以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。 在生长培养基中添加25 µL细胞，在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO2、37℃恒温箱中孵育15分钟。 注意：应单独评估每个细胞系，以确定最佳细胞密度。 细胞可以在实验的前一天或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准（CS1-CS7）; BL =空白对照； TS =测试样品。
| BL | BL | TS | TS |
| CS1 | CS1 | … | … |
| CS2 | CS2 | … | … |
| CS3 | CS3 | ||
| CS4 | CS4 | ||
| CS5 | CS5 | ||
| CS6 | CS6 | ||
| CS7 | CS7 |
表2.每个孔的试剂组成。
| 孔 | 容积 | 试剂 |
| CS1-CS7 | 25 µL | 连续稀释 |
| BL | 25 µL | 稀释剂（组分E） |
| TS | 25 µL | 测试样品 |
2.细胞裂解物中的cAMP测定
2.1根据表1和表2提供的布局，准备并添加cAMP标准品（CS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意：测试样品可以是非刺激或刺激的样品。
2.2在cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液（化合物重悬于缓冲液中），以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为25 µL /孔。
2.3将反应在室温下孵育30分钟。
2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为37.5 µL /孔。注意：对于阴性对照，可以添加裂解缓冲液。
2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，在每个孔中加入12.5 µL工作溶液，总体积为50 µL。
2.6将反应在室温下孵育30分钟。
2.7在兼容的TR-FRET（时间分辨荧光分析仪）上检测。
表3.方案总结
|
cAMP标准 |
细胞 |
||||
|
负控制 |
正控制 |
标准曲线 |
负控制 |
非刺激 |
刺激 |
|
25 µL稀释剂 |
25 µL稀释剂 |
25 µL标准液 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
25 µL细胞 |
|
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL复合缓冲液 |
25 µL化合物 |
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在室温孵育30分钟 |
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25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL裂解缓冲液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液 |
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25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液 |
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在室温孵育30分钟 |
|||||
表4.兼容的仪器汇总
| 制造商 | 仪器 |
| Berthhold Technologies | Tristar2 S; Mithras LB 940; Mithras2 LB 943 |
| Hidex | Sense; Sense Beta Plus |
| Molecular Devices | Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3 |
| Thermo Scientific | Varioskan Lux |
| Biotek | Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2 |
| BMG Labtech | PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega |
| Tecan | Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro |
图示
 图1.使用ClarioStar酶标仪（BMG）用Screen Quest FRET No Wash cAMP分析试剂盒测量了cAMP剂量反应。 |
参考文献
A cardiac mitochondrial cAMP signaling pathway regulates calcium accumulation, permeability transition and cell death
Authors: Wang Z, Liu D, Varin A, Nicolas V, Courilleau D, Mateo P, Caubere C, Rouet P, Gomez AM, V and ecasteele G, Fischmeister R, Brenner C.
Journal: Cell Death Dis (2016): e2198
Activation of P2X7 and P2Y11 purinergic receptors inhibits migration and normalizes tumor-derived endothelial cells via cAMP signaling
Authors: Avanzato, D and Genova, T and Pla, A Fiorio and Bernardini, M and Bianco, S and Bussolati, B and Mancardi, D and Giraudo, E and Maione, F and Cassoni, P and others
Journal: Scientific Reports (2016)
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The pleiotropic role of exchange protein directly activated by cAMP 1 (EPAC1) in cancer: implications for therapeutic intervention
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Journal: Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2016): 75
cAMP-Induced Histones H3 Dephosphorylation Is Independent of PKA and MAP Kinase Activations and Correlates With mTOR Inactivation
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A cAMP Biosensor-Based High-Throughput Screening Assay for Identification of Gs-Coupled GPCR Ligands and Phosphodiesterase Inhibitors
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Journal: J Biomol Screen (2015): 849
Cardiac Hypertrophy Is Inhibited by a Local Pool of cAMP Regulated by Phosphodiesterase 2
Authors: Zoccarato A, Surdo NC, Aronsen JM, Fields LA, Mancuso L, Dodoni G, Stangherlin A, Livie C, Jiang H, Sin YY, Gesellchen F, Terrin A, Baillie GS, Nicklin SA, Graham D, Szabo-Fresnais N, Krall J, V and eput F, Movsesian M, Furlan L, Corsetti V, Hamilton G, Lefkimmiatis K, Sjaastad I, Zaccolo M.
Journal: Circ Res (2015): 707
Cardiac cAMP: production, hydrolysis, modulation and detection
Authors: Boularan C, Gales C.
Journal: Front Pharmacol (2015): 203