冠状病毒（CoV）是一种可以感染人类和多种动物，因其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性，可以导致多种疾病。在2019年底，一种新型的冠状病毒被称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2），开始在全球蔓延。即使大多数受感染的患者仅患有轻度症状，例如发烧和咳嗽，但该疾病可能发展为致命的肺炎和急性呼吸衰竭病例，尤其是在多病体弱的的老人中。该病毒仅仅从出现开始的三四个月，全球已经感染了超过100万人。当前，尚无用于治疗Covid-19的任何具体有效的选择。目前，Covid-19的临床治疗主要是对症治疗，并结合上市的抗病毒药物（如瑞德昔韦和抗生素）以治疗继发感染。目前全世界都迫切需要开发抗SARS-CoV-2的特异性抗病毒治疗方法和疫苗，而冠状病毒主蛋白酶是抗CoV药物设计的重要靶点，在病毒基因表达和复制中起着关键作用。目前已掌握的治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎的成功策略是抑制蛋白水解酶消灭病毒蛋白酶。而且证明了蛋白酶抑制剂治疗病毒感染具有非常大的潜力。同样，SARS-CoV-2病毒必须要进行复制的酶便是蛋白酶，因此Covid-19是抗病毒治疗极好的靶点。

Covidyte EN450是一种包含14个氨基酸序列的肽底物，可被冠状病毒蛋白酶切割。FRET肽的”N”和”C”末端分别包含Dabcyl（淬灭剂）和Edans（供体），当该肽完整时，Edans的荧光可被Dabcy有效地淬灭。当该肽被冠状病毒蛋白酶水解时，Edans片段产生明显增强的荧光，因为其荧光不再被Dabcyl淬灭。冠状病毒蛋白酶的活性可以通过Edans的荧光强度有效地检测到。Covidyte EN450是筛选冠状病毒蛋白酶抑制剂的便捷工具。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的Covidyte肽底物系列产品。 

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适用仪器

样品实验方案

溶液配制

储备溶液配制

1.Covidyte EN450储备液（200X）：向Covidyte EN450小瓶中添加25 µL（对于cat＃13535）或250 µL（对于cat＃13536）DMSO。

注意：制成单次使用的等分试样，并储存在-20°C下。

工作溶液配制

1.Covidyte EN450工作溶液：在20 mM Tris缓冲液（pH 7.5）或自备缓冲液中以1：200稀释底物储备液。每个实验在96孔板中使用50μL底物溶液。

2.冠状病毒蛋白酶稀释：根据需要稀释冠状病毒蛋白酶。

实验步骤

（一个96孔板的样品方案）

1. 将50μLCovidyte EN450工作溶液和50μL冠状病毒蛋白酶稀释液添加到测定板的所有孔中。
2. 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 350/460 nm（截止420nm）处检测荧光的增加。 

对于动力学读数：立即开始连续不断地测量荧光强度，并每5分钟记录一次数据，持续30-120分钟。
对于终点读数：在避光的条件下，将反应在所需温度下孵育30至120分钟。然后测量荧光强度。
 

图示

图1蛋白酶在蛋白质激活、细胞调节和信号转导以及氨基酸的生成中起着至关重要的作用，用于蛋白质合成或其他代谢途径。 FRET蛋白酶底物广泛用于检测蛋白酶活性，特别是用于病毒蛋白酶的检测，这些病毒蛋白酶经常需要较长的肽序列才能实现最佳结合，例如冠状病毒，HIV和HCV蛋白酶。原理：内部淬灭的FRET肽底物被蛋白酶消化，荧光强度与蛋白酶活性成正比，从而产生高荧光的肽片段。Tide Quencher、Tide Fluor 和iFluor 染料都是研发用于高通量筛选应用的FRET蛋白酶底物的极其有效的淬灭剂。

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参考文献

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