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Amplite NADP+/NADPH检测试剂盒(比色法)增强灵敏度
货号 | 15276 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
规格 | 400 Tests | 价格 | 3840 |
Ex (nm) | 460 | Em (nm) | |
分子量 | 溶剂 | ||
产品详细介绍 |
简要概述
Amplite 总NADP和NADPH检测试剂盒 (比色法)增强灵敏度是美国AAT Bioquest研发的检测总NADP和NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色总NADP / NADPH检测试剂盒为检测总NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADPH探针是一种生色传感器,在NADP减少时具有460nm的最大吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的分析,可在100μL分析体积中检测低至0.03μM的总NADP / NADPH。与试剂盒#15260相比,该试剂盒具有更高的灵敏度。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供最优质的总NADP和NADPH检测试剂盒。
适用仪器
光吸收酶标仪 | |
吸收: | 460nm |
推荐孔板: | 透明底板 |
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备NADP / NADPH反应混合物(50μL)
加入NADPH标准品或测试样品(50μL)
在室温下孵育15分钟至2小时
监测460nm处的吸光度
注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液:
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中以制备1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。
注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物:
2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。
2.2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2.1)并充分混合。
注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液(0至2μM):
3.1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7.4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。
注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。
3.2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3.1)进行1:2连续稀释,得到1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。
3.3如表1和2中所述,将含有NADPH标准品和含NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。
注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。
表1:白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
BL |
BL |
TS |
TS |
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
NS2 |
NS2 |
|
|
NS3 |
NS3 |
|
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NS4 |
NS4 |
|
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NS5 |
NS5 |
|
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NS6 |
NS6 |
|
|
NS7 |
NS7 |
|
注意:NS = NADPH标准,BL =空白对照,TS =测试样品
表2:每个孔的试剂组成
NADPH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
*注意:将连续稀释的NADPH标准品(0.0313μM至2μM)加入NS1至NS7的孔中,一式两份。 高浓度的NADPH(例如,>30μM,最终浓度)将导致饱和信号并使校准曲线非线性。
4.在上清液反应中运行NADPH测定:
4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品的每个孔中(参见步骤3.3),使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔
注意1:对于384孔板,每孔加入25μL样品和25μLNADP/ NADPH反应混合物。
注意2:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分D)可用于裂解细胞。 (详见附录)。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。
4.3用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。
图1 使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices),在96孔白色/透明底板中用Amplite ™比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。孵育1小时(n = 3)可以检测到低至0.03μM的NADPH,在460nm处测量吸光度。
附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂
1.植物细胞样品:用200mg / mL的裂解缓冲液均质化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。
2.细菌细胞样品:离心收集细菌细胞((10,000 g,℃,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟,并用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样品:从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。
4.组织样品:称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。
参考文献
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