内源性AMPA型谷氨酸受体（AMPAR）活细胞成像试剂

LiveReceptor AMPAR

LiveReceptor AMPAR是一种可以在活细胞中对AMPA型谷氨酸受体（AMPA Receptor; AMPAR）进行特异性荧光标记的蛋白标记试剂。由于它能在活细胞中对内源性AMPAR进行标记，所以通过活细胞成像技术对生理性AMPAR进行行为分析的能力十分优秀。

 

※ 本产品是Funakoshi株式会社基于京都大学工学研究科 浜地教授的研究成果商品化而成。

※ 本产品仅供研究，研究以外不可使用。

添加LiveReceptor AMPAR至初代培养海马神经细胞进行培养后，可用荧光素对内源性AMPAR进行标记。使用LiveReceptor AMPAR，可使活神经细胞中的AMPAR可视化。

◆关于受体活细胞成像方法的问题以及配体指向性蛋白标记

■ 传统受体的成像方法及问题

配体指向性蛋白标记

为了克服过往的问题，京都大学工学研究科的浜地教授与清中准教授等人，确立了一项技术，利用蛋白表面反应基团酰基咪唑（acyl imidazole）仅对内源性目标受体蛋白进行荧光标记（图下半部分）。该方法只有在特异性配体与目标受体蛋白结合时，激活蛋白表面的反应基团酰基咪唑，可以选择性对目标受体蛋白进行荧光标记。由于接下来更换培养基可以去除多余配体和反应片段，因此可以观察到配体结合部位呈现空余状态的生理性受体蛋白行为。

参考文献：

1. Fujishima, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3961～3964 (2012).

2. Miki, et al., Chem. Biol., 21, 1013～1022 (2014).

 

■ LiveReceptor AMPAR

LiveReceptor是以神经递质受体为目标的配体指向性蛋白标记试剂。LiveReceptor AMPAR是世界上第一种AMPA型谷氨酸受体（AMPAR）特异性荧光标记试剂¹。它对阐明在记忆分子机制中发挥核心作用的AMPAR行为分析有用，并且作为脑神经基础研究为首的神经、精神疾病研究等治疗药物开发的优越试剂备受期待。

参考文献

1. Wakayama, et al., Nat. Commun., 8, 14850 (2017). [PMID : 28387242 ]Chemical labeling for visualizing native AMPA receptors in 

1. live neurons.

※ LiveReceptor AMPAR为文献中的CAM(FI)。

 

◆特点

●　可以在内源性AMPAR标记荧光素。

●　AMPAR(Glu2-4亚单位)特异性高*，不会标记其他离子通道谷氨酸受体（NMDA行谷氨酸受体、海藻酸谷氨酸受体）。

●　添加培养基， 1~4小时的标记反应后，便可进行AMPAR实时成像。

●　由于没有膜渗透性，因此仅可标记细胞表面的AMPAR。

●　在过量表达培养神经细胞、培养大脑切片组织以及AMPAR（GluA2、GluA3A或者GluA4亚基）的细胞系上有应用案例。

●　由于是小分子，组织渗透性高，在脑组织急性切片上有可以标记至深部的应用案例。

●　经电生理学方法确认，标记后的AMPAR仍然保持离子通道功能。

●　推荐使用浓度1 μM，这个浓度下几乎没有细胞毒性。

●　由于使用荧光素用作荧光色素，所以有pH反应，并且内部化的标记AMPAR趋于淬灭。因此适于观察细胞表面的AMPAR。

●　以活细胞成像为首，可用于各种应用。详情请浏览下文应用实例

 

*由于不会标记GluA1亚基，所以不能使GluA1同聚物可视化。

 

◆应用

●　活细胞成像

●　Western blot（抗荧光素抗体）

●　通过免疫沉淀（抗荧光素抗体）对AMPAR结合蛋白进行分析、研究

●　免疫染色（可以与抗其他因子的抗体进行共染色）

●　拮抗型抑制物质的探索以及活性评价

 

◆应用实例

神经细胞的活体成像

添加1 μM LiveReceptor AMPAR及荧光标记配体（FL-ligand；阴性对照）至原代海马神经细胞中培养30 min，换液后进行实时成像。荧光标记配体无法观察神经细胞的形态；与之相反，使用LiveReceptor AMPAR可以观察到神经细胞的形态以及树突棘结构。

培养切片组织的实时成像

海马的培养切片组织中，分别在含有和不含AMPAR特异性拮抗阻遏物NBQX（10 μM）的情况下，添加Live Receptor AMPAR（1 μM）。培养1小时，换液后进行实时成像。

不含NBQX（左）：可观察到树突棘结构的荧光信号。

含有AMPAR特异性阻遏物NBQX（右）：荧光信号消失。

结果显示，NBQX与 AMPAR配体的结合部位相互竞争，以及LiveReceptor AMPAR的荧光信号是AMPAR特异性的。

AMPAR特异性

A：特异性验证

用LiveReceptor AMPAR导入荧光素后，裂解细胞，以抗荧光素抗体（anti-FL）进行Western blot进行检测，获得了相当于AMPAR的GluA2亚基的105 kDa的单条带。从该条带AMPAR特异性抑制物质NBQX消失来判断AMPAR特异性。

 

B：利用免疫沉淀证明其特异性

为鉴定通过LiveReceptor AMPAR 进行荧光素标记的蛋白，不使用抗荧光素抗体（anti-FL）进行免疫沉淀，而是使用对各谷氨酸受体亚基的特异性抗体进行Western blot。结果只发现AMPA型谷氨酸受体的亚基GluA2浓缩，其余GluN（NMDA型谷氨酸受体：NMDAR）和GluK（海藻酸型谷氨酸受体：KAR）并未发现免疫沉淀引起的浓缩。

 

C：利用免疫染色比较抗GluA抗体染色图像

利用LiveReceptor AMPAR在活细胞进行荧光素标记后，固定细胞，使用抗GluA2抗体进行免疫染色。可以发现，LiveReceptor AMPAR的染色图像和使用了抗GluA2抗体的染色图像基本一致。

观察组织深部

将切片培养的小鼠大脑使用LiveReceptor AMPAR标记后，固定组织，以抗GluA2/3抗体进行免疫染色。x-y平面图像中，二者基本一致，但是从黄线部分的x-z断面可以发现，抗体组织渗透性低，只能染色切片表面。然而因为LiveReceptor AMPAR渗透到了组织深处，所以能够标记组织深层的AMPAR。（黑箭头：切片上端，白箭头：切片下端）。

 

通过FRAP分析行为分析AMPAR

用LiveReceptor AMPAR标记神经细胞内源性AMPAR并通过FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）法分析细胞膜上的AMPAR运输速度。可观察到荧光迅速恢复的情况。

Recovery ratio：16%，diffusion coefficient：0.090 μm²s^-1

 

利用药剂处理观察突触可塑性

使用LiveReceptor AMPAR标记培养海马神经细胞后，用NMDA（50 μM）处理10 min并使用化学性LTD（Long-term depression；长时程抑制）诱导。在LTD诱导条件下，可观察到树突棘中标记AMPAR的数量明显减少。

拮抗抑制物质探索性筛选

A：由于LiveReceptor AMPAR使用AMPAR特异性配体进行标记，因此可用于探索与AMPAR配体拮抗的抑制物质和拮抗

A：剂（competitive antagonist）。

A：可在细胞、组织中确认，LiveReceptor的标记显著收到AMPAR特异性抑制物质NBQX抑制。

B上部分：AMPAR大量表达细胞，B下部分：组织